Summary

Modificación de vectores de expresión de Baculovirus para producir secretado proteínas vegetales en células de los insectos

Published: August 20, 2018
doi:

Summary

Aquí, presentamos los protocolos para la utilización de la célula y baculovirus proteína expresión sistema insecto para producir grandes cantidades de proteínas vegetales segregada para la cristalización de proteínas. Un vector de expresión de baculovirus se ha modificado con GP67 o insectos hemolin péptido señal para la expresión de la secreción de la proteína de planta en células de los insectos.

Abstract

Ha sido un reto para los científicos expresar proteínas recombinantes de eucariotas secretores para estudios estructurales y bioquímicos. El sistema de expresión celular de insecto baculovirus-mediada es uno de los sistemas utilizados para expresar proteínas secretoras eucarióticas recombinantes con algunas modificaciones poste-de translación. Las proteínas secretoras que deba canalizarse a través de las vías secretoras de glycosylation de la proteína, formación de enlaces disulfuro y otras modificaciones poste-de translación. Para mejorar la expresión de células de insectos existentes de proteínas secretoras de vegetales, un vector de expresión de baculovirus se modifica por la adición de un GP67 o una secuencia de péptido señal hemolin entre el promotor y la clonación de múltiples sitios. Este sistema de nuevo diseño vector modificado había producido con éxito un alto rendimiento de proteínas de receptor soluble recombinante planta secretada de Arabidopsis thaliana. Dos de las proteínas de la planta expresada, los dominios extracelulares de los receptores de membrana plasmática de Arabidopsis TDR y PRK3, se cristalizaron para estudios cristalográficos de rayos x. El sistema vector modificado es una herramienta mejorada que potencialmente puede ser utilizada para la expresión de proteínas recombinantes secretores en el reino animal también.

Introduction

Es imprescindible para un laboratorio de investigación ser capaces de producir grandes cantidades de proteínas recombinantes homogéneas para caracterizaciones bioquímicas y biofísicas, especialmente para estudios cristalográficos de rayos x. Existen muchos sistemas de expresión heteróloga bien establecido como Escherichia coli, levaduras, células de los insectos, células de mamíferos, células de la planta, etc. entre ellos, el sistema de expresión celular de insecto baculovirus-mediada es uno de los más usan técnicas para producir grandes cantidades de proteínas eucarióticas recombinantes gran tamaño estructural plegadas para la cristalización de proteínas1.

Los vectores de expresión del sistema de expresión de baculovirus se han diseñado para contener una fuerte polyhedrin o promotor de P10 para producir un alto rendimiento de proteínas recombinantes intracelular2,3. Para hacer un baculovirus recombinante, se clona el gen de interés en un insecto vector que contiene el locus polyhedrin (polh) del genoma de nucleopolyhedroviral múltiple de Autographa californica . La construcción resultante luego se ordena y se verifica su marco correcto de lectura abierta (ORF). La construcción correcta es entonces introducida en la célula de insecto huésped a través del proceso de transfección. El gen de interés se inserta en el genoma viral por recombinación homóloga. Este evento resulta en la producción del genoma viral recombinante, que luego se replica en producir recombinantes reverdeció de partículas de virus1.

Las células de los insectos que comúnmente se utilizan en el sistema de expresión son Sf9 y cinco celdas (Hi5). Las células SF9 son un aislamiento clonal de Sf21, derivado de las células ováricas pupas de Spodoptera frugiperda, y células de Hi5 un aislamiento clonal derivado de la parental Trichoplusia ni ovárico de la célula línea TN-3684,5. Transfecciones Co, amplificación virus y ensayos de placa se llevan a cabo en las células Sf9, mientras que las células Hi5 típicamente se seleccionan para producir mayores cantidades de proteínas recombinantes6. Cabe destacar que las células de Hi5 no son adecuadas para la generación y amplificación de progenie del virus debido a su tendencia a producir virus mutantes. Tradicionalmente, un rango de temperatura de 25-30 ° C se considera buena para el cultivo de células de los insectos. Sin embargo, se ha reportado que 27-28 ° C es la temperatura óptima para el insecto célula crecimiento e infección7,8.

La introducción de una secuencia de señal fuerte precede el gene es necesario para la alta expresión de las proteínas secretadas. La secuencia de la señal guía eficientemente la proteína recombinante traducida en el retículo endoplásmico para la secreción de proteínas y modificaciones postraduccionales necesarias para el plegamiento correcto y estabilización3. Secuencias de péptidos de señal, tales como el baculovirus envuelven proteína GP64/67, abeja melitina y otros, han sido elegidas para facilitar la expresión de proteínas recombinantes secretores en los sistemas de expresión de baculovirus-mediada3. La introducción del péptido señal de GP67 ha demostrado para mejorar el rendimiento de la expresión de una proteína recombinante secretada, en comparación con usando el péptido señal intrínseca del objetivo gen9. Hemolin es una proteína de la hemolinfa de la polilla de seda gigante Hyalophora cecropia, inducida por bacterias infección10. Debido al relativamente alto nivel de expresión inducida, puede utilizarse la secuencia del péptido de señal del gen para mediar en la expresión de la secreción de proteínas recombinantes en el sistema de células de insecto baculovirus.

La a. thaliana Tracheary elementos diferenciación inhibidor Factor Receptor (TDR) y el polen del Receptor quinasa 3 (PRK3), ambos pertenecen a la Leucine-rich Repeat Receptor-como Kinase (LRR-RLK) familia de proteínas11,12 . Para estudiar la estructura y la función de esta familia de receptores proteínas vegetales, así como para facilitar la caracterización bioquímica y estructural de otras proteínas vegetales secretada, se ha modificado el sistema de expresión de baculovirus-insecto célula a mejorar el rendimiento de producción y calidad de proteína. Los dominios extracelulares de TDR y PRK3 se han expresado con éxito mediante dos vectores de expresión modificada en el sistema de expresión de células de insecto baculovirus. Tanto los dominios extracelulares de proteínas TDR y PRK3 han se ha cristalizado. Este artículo divulga la expresión y purificación de grandes cantidades de proteínas recombinantes secretadas planta con vectores de expresión de baculovirus modificados dos incorporando un GP67 o una secuencia de señal hemolin entre el promotor y múltiples sitios.

Protocol

Nota: Se utiliza un sistema de células de insecto/baculovirus con vectores de expresión modificada de expresión de la proteína secretora de la planta y la cristalización. 1. modificación de un Vector de expresión de Baculovirus con el péptido de señal GP67 para la expresión de la secreción de la proteína de planta Sintetizar un fragmento de ADN que contiene una 5′ BglII corte sitio13, la secuencia de señal GP67 secreción y un sitio de clonación …

Representative Results

Como se muestra en la figura 1, se utilizaron dos vectores de expresión de baculovirus modificados pFastBac1 para expresar las proteínas secretadas con la GP67 o la secuencia de señal hemolin para reemplazar la secuencia de la señal intrínseca de la gene de la blanco. GP67 viral y los genes de insectos hemolin han demostrado tener niveles de expresión de alta secreción en las células. Se espera que las proteínas de fusión con cualquiera de estas dos…

Discussion

Dada la diversidad de tamaño y estabilidad de los miles de proteínas presentes en los sistemas biológicos, a menudo es empírica para la investigación de un laboratorio para decidir qué sistema de expresión heteróloga debe elegirse para la expresión de una proteína específica. El sistema de expresión de e. coli es a menudo la primera opción para la expresión de la proteína debido al corto ciclo de vida de las bacterias, bajo costos de los medios de cultivo y la relativa facilidad para escalar<sup c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por los nuevos fondos de inicio de la Facultad de la Universidad Estatal de Carolina del norte para Guozhou Xu.

Materials

Incubator shaker VWR Model Excella E25 27 oC
Incubator VWR Model 2005 27 oC
Centrifuge BECKMAN Model J-6 with a swing bucket rotor
Herculase II Fusion DNA Polymerase Agilent 600677-51 For PCR amplification of DNA
Thermal Cycler BIO-RAD Model C1000 Touch For PCR amplification of DNA
Incubator shaker New Brunswick Scientific Model I 24 For growing baceria culture
Customer DNA synthesis GENSCRIPT
BamHI (HF) New England Biolabs R3136S Restriction Endonuclease
BglII New England Biolabs R0144S Restriction Endonuclease
NotI (HF) New England Biolabs R3189S Restriction Endonuclease
XhoI New England Biolabs R0146S Restriction Endonuclease
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202T DNA ligation
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 DNA purification from Agorase gel
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104 Plasmid DNA purification from bacteria culture
Agarose Thermo Fisher Scientific 15510-019 For DNA gel electropherosis
MAX Efficiency DH5α competen cell Invitrogen 18-258-012 For transformation of DNA ligation mixture
Lennox L LB Broth Research Product International Corp. L24066-5000.0 For making bacteria culture
Ampicillin sodium salt Thermo Fisher Scientific 11593-019 Antibiotics
Kanamycin Sulfate Thermo Fisher Scientific 15160-054 Antibiotics
Tetracycline Thermo Fisher Scientific 64-75-5 Antibiotics
Gentamicin Thermo Fisher Scientific 15710-064 Antibiotics
MAX Efficiency DH10Bac competent cells Thermo Fisher Scientific 10361-012 For making bacmid DNA
S.O.C. Medium Thermo Fisher Scientific 15544-034 For DNA transformation
CellFECTIN II Reagent Thermo Fisher Scientific 10362-101 Insect cell transfection reagent
Bac-to-Bac Expression System Thermo Fisher Scientific 10359-016 Baculovirus-insect cells expression kit
Bluo-gal Thermo Fisher Scientific 15519-028 For isolation of recominant Bacmid DNA
IPTG Thermo Fisher Scientific 15529-019 For isolation of recominant Bacmid DNA
pFastBac1 Thermo Fisher Scientific 10360014 Baculorirus expression vector
Sf9 cells Thermo Fisher Scientific 11496015 Sf9 monolayer cells
Hi5 cells Thermo Fisher Scientific B85502 High Five insect cells
Grace’s insect medium, unsupplemented Thermo Fisher Scientific 11595030 Sf9 cell transfection minimum medium
Grace’s insect medium, supplemented Thermo Fisher Scientific 11605102 Sf9 monolayer cell culture complete medium
Sf-900 II SFM Thermo Fisher Scientific 10902104 Sf9 suspension cell culture medium without FBS
Express Five SFM Thermo Fisher Scientific 10486025 Hi5 cell culture medium
Penicillin-Streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15140122 100 ml (10,000 I.U./ml)
L-Glutamine (200 mM)  Thermo Fisher Scientific 25030081 100 ml
FBS Certified Thermo Fisher Scientific 16000-044 500 ml
6-well plates Thermo Fisher Scientific 08-772-1B Flat-bottom
150 mm plates Thermo Fisher Scientific 353025 100/case
1.5 ml Microcentrifuge Tubes USA Scientific 1415-2500 500 tubes/bag
15 ml conical screw cap centrifuge tubes USA Scientific 1475-0511 25 tubes/bag
50 ml conical screw cap centrifuge tubes USA Scientific 1500-1211 25 tubes/bag
Ni-NTA Superflow Qiagen 30430 NiNTA resin
pH-indicator strips EMD Millipore Corporation 1.09535.0001 pH 0 – 14

References

  1. Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnology Progress. 30, 1-18 (2014).
  2. Khan, S., Ng, M. L., Tan, Y. J. Expression of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 3a protein and the assembly of coronavirus-like particles in the baculovirus expression system. Methods in Molecular Biology. 379, 35-50 (2007).
  3. Possee, R. D., King, L. A. Baculovirus Transfer Vectors. Methods in Molecular Biology. 1350, 51-71 (2016).
  4. Vaughn, J. L., Goodwin, R. H., Tompkins, G. J., McCawley, P. The establishment of two cell lines from the insect Spodoptera frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae). In Vitro. 13, 213-217 (1977).
  5. Hink, W. F. Established insect cell line from the cabbage looper, Trichoplusia ni. Nature. 226, 466-467 (1970).
  6. Davis, T. R., et al. Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines. In Vitro Cellular & Development Biology – Animal. 29A, 388-390 (1993).
  7. Wickham, T. J., Nemerow, G. R. Optimization of growth methods and recombinant protein production in BTI-Tn-5B1-4 insect cells using the baculovirus expression system. Biotechnology Progress. 9, 25-30 (1993).
  8. Davis, T. R., Trotter, K. M., Granados, R. R., Wood, H. A. Baculovirus expression of alkaline phosphatase as a reporter gene for evaluation of production, glycosylation and secretion. Nature Biotechnology. 10, 1148-1150 (1992).
  9. Murphy, C. I., et al. Enhanced expression, secretion, and large-scale purification of recombinant HIV-1 gp120 in insect cell using the baculovirus egt and p67 signal peptides. Protein Expression and Purification. 4, 349-357 (1993).
  10. Sun, S. C., Lindstrom, I., Boman, H. G., Faye, I., Schmidt, O. Hemolin: an insect-immune protein belonging to the immunoglobulin superfamily. Science. 250, 1729-1732 (1990).
  11. Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. Differential CLE peptide perception by plant receptors implicated from structural and functional analyses of TDIF-TDR interactions. PLoS One. 12, e0175317 (2017).
  12. Chakraborty, S., Pan, H., Tang, Q., Woolard, C., Xu, G. The Extracellular Domain of Pollen Receptor Kinase 3 is structurally similar to the SERK family of co-receptors. Scientific Reports. 8, 2796 (2018).
  13. Khorana, H. G. Total synthesis of a gene. Science. 203, 614-625 (1979).
  14. Bahl, C. P., Marians, K. J., Wu, R. A general method for inserting specific DNA sequences into cloning vehicles. Gene. 1, 81-92 (1976).
  15. Xu, W., Zhang, Y. Isolation and Characterization of Vaccine-Derived Polioviruses, Relevance for the Global Polio Eradication Initiative. Methods in Molecular Biology. 1387, 213-226 (2016).
  16. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166, 557-580 (1983).
  17. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
  18. Reddy, B. G., et al. Expression and purification of the alpha subunit of the epithelial sodium channel, ENaC. Protein Expression and Purification. 117, 67-75 (2016).
  19. Harris, T. J., Emtage, J. S. Expression of heterologous genes in E. coli. Microbiological Sciences. 3, 28-31 (1986).
  20. Kaur, J., Kumar, A., Kaur, J. Strategies for optimization of heterologous protein expression in E. coli: Roadblocks and reinforcements. International Journal of BIological Macromolecules. 106, 803-822 (2018).
  21. Guo, Y., Yang, F., Tang, X. An Overview of Protein Secretion in Yeast and Animal Cells. Methods in Molecular Biology. 1662, 1-17 (2017).
  22. Blight, M. A., Chervaux, C., Holland, I. B. Protein secretion pathway in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 5, 468-474 (1994).
  23. Idiris, A., Tohda, H., Kumagai, H., Takegawa, K. Engineering of protein secretion in yeast: strategies and impact on protein production. Applied Microbiology and Biotechnology. 86, 403-417 (2010).
  24. Wormald, M. R., Dwek, R. A. Glycoproteins: glycan presentation and protein-fold stability. Structure. 7, R155-R160 (1999).
  25. Geisler, C., Mabashi-Asazuma, H., Jarvis, D. L. An Overview and History of Glyco-Engineering in Insect Expression Systems. Methods in Molecular Biology. 1321, 131-152 (2015).
  26. Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. X-ray crystallographic studies of the extracellular domain of the first plant ATP receptor, DORN1, and the orthologous protein from Camelina sativa. Acta Crystallographica Section F: Structural BIology and Crystallization Communications. 72, 782-787 (2016).
  27. Aricescu, A. R., Owens, R. J. Expression of recombinant glycoproteins in mammalian cells: towards an integrative approach to structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 23, 345-356 (2013).
  28. Reuter, L. J., Bailey, M. J., Joensuu, J. J., Ritala, A. Scale-up of hydrophobin-assisted recombinant protein production in tobacco BY-2 suspension cells. Plant Biotechnology Journal. 12, 402-410 (2014).
  29. Dohi, K., et al. Inducible virus-mediated expression of a foreign protein in suspension-cultured plant cells. Archives of Virology. 151, 1075-1084 (2006).

Play Video

Cite This Article
Chakraborty, S., Trihemasava, K., Xu, G. Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells. J. Vis. Exp. (138), e58283, doi:10.3791/58283 (2018).

View Video