Wijzigen Baculovirus expressievectoren voor de productie van plantaardige eiwitten in Insect cellen uitgescheiden
Summary
Hier presenteren we de protocollen voor het gebruik van het insect cel en baculovirus eiwit expressie systeem voor de productie van grote hoeveelheden uitgescheiden eiwithoudende gewassen voor eiwit kristallisatie. Een vector baculovirus expressie is gewijzigd met GP67 of insect hemolin signaal peptide voor plant secretie eiwituitdrukking in insect cellen.
Abstract
Het is een uitdaging voor de wetenschappers uitspreken recombinant secretoire eukaryotische eiwit voor structurele en biochemische studies geweest. Het insect cel baculovirus-gemedieerde expressie systeem is een van de systemen die worden gebruikt om uit te drukken van recombinante eukaryotische secretoire eiwitten met sommige posttranslationele modificaties. De secretoire eiwitten moeten worden gerouteerd via de secretoire trajecten voor eiwit glycosylatie, disulfide bindingen vorming en andere posttranslationele modificaties. Ter verbetering van de bestaande insect cel uitdrukking van secretoire plantaardige eiwitten, wordt een baculovirus expressie vector gewijzigd door de toevoeging van hetzij een GP67 of een hemolin signaal peptide sequentie tussen de promotor en klonen van meerdere sites. Dit nieuw ontworpen gemodificeerde vector-systeem met succes geproduceerd van een hoog rendement van oplosbare recombinante secreted receptor eiwithoudende gewassen van Arabidopsis thaliana. Twee van de geuite plantaardige eiwitten, de extracellulaire domeinen van Arabidopsis TDR en PRK3 plasmamembraan receptoren, werden kristalliseerde voor X-ray kristallografische studies. Het systeem gemodificeerde vector is een verbeterd gereedschap die potentieel kan worden gebruikt voor de expressie van recombinante secretoire eiwitten in het dierenrijk alsmede.
Introduction
Het is noodzakelijk voor een onderzoekslaboratorium te zijn geschikt voor het produceren van grote hoeveelheden van homogene recombinante eiwitten voor biochemische en biofysische karakteristieken, vooral voor X-ray kristallografische studies. Er zijn vele gevestigde heterologe expressiesystemen zoals Escherichia coli, gist, insect cellen, cellen van zoogdieren, plantencellen, etc. onder hen, het insect cel baculovirus-gemedieerde expressie systeem is een van de meest gebruikte technieken voor de productie van grote hoeveelheden van structureel gevouwen grote recombinante eukaryotische eiwitten voor eiwit kristallisatie1.
De expressievectoren van de baculovirus expressie systemen zijn ontworpen om te bevatten een sterke polyhedrin of P10 promotor voor de productie van een hoog rendement van recombinante intracellulaire eiwitten2,3. Het gen van belang is om een recombinant baculovirus, gekloond in een insect vector met de locus polyhedrin (polh) van het genoom van de multi-nucleopolyhedroviral Autographa californica . De resulterende construct is vervolgens sequenced en de juiste open leesraam (ORF) is geverifieerd. De juiste constructie wordt vervolgens ingevoerd in de gastheercel insecten door het proces van transfectie. Het gen van belang is ingevoegd in het virale genoom homologe recombinatie. Dit evenement resulteert in de productie van de recombinante virale genoom, die vervolgens wordt gerepliceerd naar het produceren van recombinant bloesem virus deeltjes1.
Het insect cellen die het meest worden gebruikt in de expressie systemen zijn Sf9 en hoge vijf (Hi5) cellen. Sf9 cellen zijn een klonale isolaat van Sf21, afgeleid van de pop ovariale cellen van Spodoptera frugiperda, en Hi5 cellen zijn een klonale isolaat afgeleid van de ouderlijke Trichoplusia ni ovariële cel lijn TN-3684,5. Co transfections, virus versterking en plaque tests worden uitgevoerd op Sf9 cellen, terwijl Hi5 cellen zijn meestal geselecteerd voor de productie van grotere hoeveelheden van recombinante eiwitten6. Het is vermeldenswaard dat de Hi5 cellen niet geschikt voor het genereren en versterking van virus nakomelingschap vanwege hun neiging zijn tot mutant virussen. Traditioneel, een temperatuurbereik van 25-30 ° C wordt beschouwd als goed voor de teelt van insect cellen. Er is echter gemeld dat 27-28 ° C de optimale temperatuur voor het insect cel groei en infectie7,8 is.
De invoering van een krachtig signaal reeks voorafgaand aan het gen is nodig voor de hoge expressie van de secreted eiwitten. De volgorde van het signaal zou efficiënt begeleiden de vertaalde recombinante eiwitten in het endoplasmatisch reticulum voor eiwit secretie en posttranslationele modificaties noodzakelijk voor goede vouwen en stabilisatie3. Signaal peptide reeksen, hebben zoals de baculovirus omhullen eiwit GP64/67, honingbij melittin, en anderen, uitgekozen om de uitdrukking van secretoire recombinant eiwit in de uitdrukking baculovirus-gemedieerde systemen3. De invoering van de signaal-peptide van GP67 is aangetoond dat het verbeteren van het rendement van de expressie van een secreted recombinant eiwit, in vergelijking met het gebruik van de intrinsieke signaal peptide van de doelgroep gene9. Hemolin is een Hemolymfe proteïne van de gigantische zijde vlinder Hyalophora cecropia, geïnduceerde op bacteriën infectie10. Vanwege de relatief hoge niveau van geïnduceerde expressie, kan het signaal peptide sequentie van het gen worden gebruikt om te bemiddelen de expressie van de secretie van de recombinante eiwitten in het baculovirus-insect cell systeem.
De A. thaliana Tracheary Element differentiatie remmende Factor Receptor (TDR) en stuifmeel Receptor Kinase 3 (PRK3) beide tot de familie van de herhaling Receptor-achtig Kinase (LRR-RLK) plant Leucine-rijke eiwitten11,12 behoren . Om de structuur en functie van deze familie van receptor eiwithoudende gewassen, alsmede over het vergemakkelijken van de structurele en Biochemische karakterisering van andere plantaardige uitgescheiden eiwitten te bestuderen, is het baculovirus-insect cel expressie systeem gewijzigd om te verbeteren eiwit kwaliteit en productie opbrengst. De extracellulaire domeinen van zowel de TDR en de PRK3 is met succes geuit met behulp van twee gewijzigde expressievectoren in het baculovirus-insect cel expressie systeem. Zowel de extracellulaire domeinen van TDR en PRK3 eiwitten hebben is uitgekristalliseerd. Dit artikel rapporteert de uitdrukking en de zuivering van grote hoeveelheden van recombinante secreted plantaardige eiwitten met twee gewijzigde baculovirus expressievectoren door het opnemen van een GP67 of een hemolin signaal reeks tussen de promotor en meerdere klonen sites.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gezien de diversiteit in grootte en stabiliteit van de duizenden eiwitten aanwezig in de biologische systemen, is het vaak empirische voor een onderzoek laboratorium om te beslissen welk heterologe expressie systeem moet worden gekozen voor de uitdrukking van een specifieke proteïne. Het systeem van E. coli expressie is vaak de eerste keuze voor eiwit expressie als gevolg van de korte levenscyclus van de bacteriën, lage kosten van de voedingsbodems, en het relatieve gemak aan schaal omhoog19<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de nieuwe faculteit opstarten fondsen van de North Carolina State University voor Guozhou Xu.
Materials
| Incubator shaker | VWR | Model Excella E25 | 27 oC |
| Incubator | VWR | Model 2005 | 27 oC |
| Centrifuge | BECKMAN | Model J-6 | with a swing bucket rotor |
| Herculase II Fusion DNA Polymerase | Agilent | 600677-51 | For PCR amplification of DNA |
| Thermal Cycler | BIO-RAD | Model C1000 Touch | For PCR amplification of DNA |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | Model I 24 | For growing baceria culture |
| Customer DNA synthesis | GENSCRIPT | ||
| BamHI (HF) | New England Biolabs | R3136S | Restriction Endonuclease |
| BglII | New England Biolabs | R0144S | Restriction Endonuclease |
| NotI (HF) | New England Biolabs | R3189S | Restriction Endonuclease |
| XhoI | New England Biolabs | R0146S | Restriction Endonuclease |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202T | DNA ligation |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | DNA purification from Agorase gel |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Plasmid DNA purification from bacteria culture |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | 15510-019 | For DNA gel electropherosis |
| MAX Efficiency DH5α competen cell | Invitrogen | 18-258-012 | For transformation of DNA ligation mixture |
| Lennox L LB Broth | Research Product International Corp. | L24066-5000.0 | For making bacteria culture |
| Ampicillin sodium salt | Thermo Fisher Scientific | 11593-019 | Antibiotics |
| Kanamycin Sulfate | Thermo Fisher Scientific | 15160-054 | Antibiotics |
| Tetracycline | Thermo Fisher Scientific | 64-75-5 | Antibiotics |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710-064 | Antibiotics |
| MAX Efficiency DH10Bac competent cells | Thermo Fisher Scientific | 10361-012 | For making bacmid DNA |
| S.O.C. Medium | Thermo Fisher Scientific | 15544-034 | For DNA transformation |
| CellFECTIN II Reagent | Thermo Fisher Scientific | 10362-101 | Insect cell transfection reagent |
| Bac-to-Bac Expression System | Thermo Fisher Scientific | 10359-016 | Baculovirus-insect cells expression kit |
| Bluo-gal | Thermo Fisher Scientific | 15519-028 | For isolation of recominant Bacmid DNA |
| IPTG | Thermo Fisher Scientific | 15529-019 | For isolation of recominant Bacmid DNA |
| pFastBac1 | Thermo Fisher Scientific | 10360014 | Baculorirus expression vector |
| Sf9 cells | Thermo Fisher Scientific | 11496015 | Sf9 monolayer cells |
| Hi5 cells | Thermo Fisher Scientific | B85502 | High Five insect cells |
| Grace’s insect medium, unsupplemented | Thermo Fisher Scientific | 11595030 | Sf9 cell transfection minimum medium |
| Grace’s insect medium, supplemented | Thermo Fisher Scientific | 11605102 | Sf9 monolayer cell culture complete medium |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher Scientific | 10902104 | Sf9 suspension cell culture medium without FBS |
| Express Five SFM | Thermo Fisher Scientific | 10486025 | Hi5 cell culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 ml (10,000 I.U./ml) |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | 100 ml |
| FBS Certified | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | 500 ml |
| 6-well plates | Thermo Fisher Scientific | 08-772-1B | Flat-bottom |
| 150 mm plates | Thermo Fisher Scientific | 353025 | 100/case |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 500 tubes/bag |
| 15 ml conical screw cap centrifuge tubes | USA Scientific | 1475-0511 | 25 tubes/bag |
| 50 ml conical screw cap centrifuge tubes | USA Scientific | 1500-1211 | 25 tubes/bag |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | NiNTA resin |
| pH-indicator strips | EMD Millipore Corporation | 1.09535.0001 | pH 0 – 14 |
References
- Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnology Progress. 30, 1-18 (2014).
- Khan, S., Ng, M. L., Tan, Y. J. Expression of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 3a protein and the assembly of coronavirus-like particles in the baculovirus expression system. Methods in Molecular Biology. 379, 35-50 (2007).
- Possee, R. D., King, L. A. Baculovirus Transfer Vectors. Methods in Molecular Biology. 1350, 51-71 (2016).
- Vaughn, J. L., Goodwin, R. H., Tompkins, G. J., McCawley, P. The establishment of two cell lines from the insect Spodoptera frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae). In Vitro. 13, 213-217 (1977).
- Hink, W. F. Established insect cell line from the cabbage looper, Trichoplusia ni. Nature. 226, 466-467 (1970).
- Davis, T. R., et al. Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines. In Vitro Cellular & Development Biology – Animal. 29A, 388-390 (1993).
- Wickham, T. J., Nemerow, G. R. Optimization of growth methods and recombinant protein production in BTI-Tn-5B1-4 insect cells using the baculovirus expression system. Biotechnology Progress. 9, 25-30 (1993).
- Davis, T. R., Trotter, K. M., Granados, R. R., Wood, H. A. Baculovirus expression of alkaline phosphatase as a reporter gene for evaluation of production, glycosylation and secretion. Nature Biotechnology. 10, 1148-1150 (1992).
- Murphy, C. I., et al. Enhanced expression, secretion, and large-scale purification of recombinant HIV-1 gp120 in insect cell using the baculovirus egt and p67 signal peptides. Protein Expression and Purification. 4, 349-357 (1993).
- Sun, S. C., Lindstrom, I., Boman, H. G., Faye, I., Schmidt, O. Hemolin: an insect-immune protein belonging to the immunoglobulin superfamily. Science. 250, 1729-1732 (1990).
- Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. Differential CLE peptide perception by plant receptors implicated from structural and functional analyses of TDIF-TDR interactions. PLoS One. 12, e0175317 (2017).
- Chakraborty, S., Pan, H., Tang, Q., Woolard, C., Xu, G. The Extracellular Domain of Pollen Receptor Kinase 3 is structurally similar to the SERK family of co-receptors. Scientific Reports. 8, 2796 (2018).
- Khorana, H. G. Total synthesis of a gene. Science. 203, 614-625 (1979).
- Bahl, C. P., Marians, K. J., Wu, R. A general method for inserting specific DNA sequences into cloning vehicles. Gene. 1, 81-92 (1976).
- Xu, W., Zhang, Y. Isolation and Characterization of Vaccine-Derived Polioviruses, Relevance for the Global Polio Eradication Initiative. Methods in Molecular Biology. 1387, 213-226 (2016).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166, 557-580 (1983).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
- Reddy, B. G., et al. Expression and purification of the alpha subunit of the epithelial sodium channel, ENaC. Protein Expression and Purification. 117, 67-75 (2016).
- Harris, T. J., Emtage, J. S. Expression of heterologous genes in E. coli. Microbiological Sciences. 3, 28-31 (1986).
- Kaur, J., Kumar, A., Kaur, J. Strategies for optimization of heterologous protein expression in E. coli: Roadblocks and reinforcements. International Journal of BIological Macromolecules. 106, 803-822 (2018).
- Guo, Y., Yang, F., Tang, X. An Overview of Protein Secretion in Yeast and Animal Cells. Methods in Molecular Biology. 1662, 1-17 (2017).
- Blight, M. A., Chervaux, C., Holland, I. B. Protein secretion pathway in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 5, 468-474 (1994).
- Idiris, A., Tohda, H., Kumagai, H., Takegawa, K. Engineering of protein secretion in yeast: strategies and impact on protein production. Applied Microbiology and Biotechnology. 86, 403-417 (2010).
- Wormald, M. R., Dwek, R. A. Glycoproteins: glycan presentation and protein-fold stability. Structure. 7, R155-R160 (1999).
- Geisler, C., Mabashi-Asazuma, H., Jarvis, D. L. An Overview and History of Glyco-Engineering in Insect Expression Systems. Methods in Molecular Biology. 1321, 131-152 (2015).
- Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. X-ray crystallographic studies of the extracellular domain of the first plant ATP receptor, DORN1, and the orthologous protein from Camelina sativa. Acta Crystallographica Section F: Structural BIology and Crystallization Communications. 72, 782-787 (2016).
- Aricescu, A. R., Owens, R. J. Expression of recombinant glycoproteins in mammalian cells: towards an integrative approach to structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 23, 345-356 (2013).
- Reuter, L. J., Bailey, M. J., Joensuu, J. J., Ritala, A. Scale-up of hydrophobin-assisted recombinant protein production in tobacco BY-2 suspension cells. Plant Biotechnology Journal. 12, 402-410 (2014).
- Dohi, K., et al. Inducible virus-mediated expression of a foreign protein in suspension-cultured plant cells. Archives of Virology. 151, 1075-1084 (2006).
