Summary

Engineering-Transplantation geeignet retinalen Pigment Epithel Gewebe abgeleitet aus humanen embryonalen Stammzellen

Published: September 06, 2018
doi:

Summary

Wir beschreiben eine Methode um eine netzhautgewebe bestehend aus retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen gezüchtet auf menschliche amniotic Membranen und deren Vorbereitung für die Verpflanzung in Tiermodellen zu konstruieren.

Abstract

Mehreren pathologische Zuständen des Auges beeinträchtigen die Funktionalität bzw. das Überleben des retinalen Pigmentepithels (RPE). Dazu gehören einige Formen der Retinitis Pigmentosa (RP) und Altersbedingte Makula-Degeneration (AMD). Zelltherapie ist eines der vielversprechendsten therapeutischen Strategien vorgeschlagen, diese Krankheiten bereits ermutigende Zwischenstand beim Menschen zu heilen. Die Methode der Zubereitung des Transplantats hat jedoch erhebliche Auswirkungen auf die funktionellen Ergebnisse in Vivo. RPE-Zellen als eine Zellsuspension gepfropft sind nämlich weniger funktional als die gleichen Zellen als eine netzhautgewebe transplantiert. Hier beschreiben wir eine einfache und reproduzierbare Methode, Ingenieur RPE Gewebe und deren Vorbereitung für eine Implantation in Vivo . RPE Zellen aus menschlichen pluripotente Stammzellen sind auf eine biologische Unterstützung, die menschlichen amniotic Membrane (Schinken) ausgesät. Im Vergleich zu künstlichen Gerüste, hat diese Unterstützung den Vorteil, dass eine Basalmembran, die in der Nähe der Bruch-Membran ist wo endogene RPE-Zellen verbunden sind. Jedoch seine Manipulation ist nicht einfach, und wir mehrere Strategien für seine ordnungsgemäße Kultivierung und Vorbereitung für die Verpflanzung in Vivoentwickelt.

Introduction

RPE ist entscheidend für das Überleben und die Homöostase der Photorezeptoren mit denen sie eng verbunden1ist. Verschiedene pathologische Zustände verändern seine Funktionalität und/oder überleben, darunter RP und AMD.

RP ist eine Gruppe von geerbten monogenen Mutationen, die die Funktionen der Photorezeptoren oder RPE-Zellen oder beide2,3betreffen. Es wird geschätzt, dass Mutationen, die betreffen speziell die RPE Zellen machen 5 % der RP2. AMD ist eine weitere Bedingung wo die RPE-Schicht verändert ist, führende letztlich zu zentralen Sehverlust. AMD wird durch das komplexe Zusammenspiel von genetischen und umweltbedingten Faktoren verursacht und wirkt sich auf die ältere4,5,6. Prognosen zufolge wird AMD eine Sorge um 196 Millionen Patienten weltweit durch 20207sein. Bei diesen Erkrankungen keine wirksame Heilung gibt, und eine der vorgeschlagenen Strategien ist die Transplantation von neuen RPE-Zellen um Toten/nicht funktionsfähige vorbestehenden RPE Zellen8zu kompensieren.

Die Formulierung des Endproduktes, veredelt werden ist wichtig, um die besten funktionellen Ergebnisse sicherzustellen. RPE-Zellen als eine Zellsuspension, trotz des Seins eine einfach Art der Lieferung, injiziert Bedenken bezüglich deren Überleben, Integration und Funktionalität9,10,11,12 , 13. Wissenschaftler entwickeln jetzt mehr komplexe Rezepturen liefern entwickelt netzhautgewebe9,13,14,15,16. In diesem Zusammenhang entwickelten wir eine originelle Methode zur in-vitro- RPE Gewebe zu generieren, die für die Transplantation9verwendet werden könnten.

RPE zellbanken abgeleitet von menschlichen embryonalen Stammzellen (ES) sind in diesem Protokoll verwendet. Jedoch Alternative RPE Zellen Banken aus verschiedenen Zelle Quellen (Human-induzierte pluripotente Stammzellen, primäre RPE-Zellen usw.)und differenziert mit einer anderen Methode eignen sich auch für dieses Protokoll. Freuen Sie sich auf gezielte Differenzierung Protokolle mit Zytokinen und/oder kleine Moleküle17,18,19,20,21,22.

Um transplantiert werden, sollte das technische Gewebe auf einem Gerüst vorbereitet werden. In den letzten Jahren wurden verschiedene Gerüste basierend auf ein Polymer oder eine Matrix von biologischen Ursprungs13,23,24entwickelt. Hier, die biologische Substrat verwendet ist der Schinken, aber andere Substrate wie entblößt Bruch Membranen umgesetzt werden könnte. Die hier beschriebene Methode hat den Vorteil der Verwendung einer biologischen Gerüst, das für die RPE nativen Umgebung relevant ist.

Menschlichen ES Zellen gewonnenen RPE-Zellen sind für mindestens 4 Wochen kultiviert, um voll und ganz als ein Kopfsteinpflaster Monolage organisiert werden. In diesem Stadium das Epithel erhalten ist funktional und9polarisiert. Da dieses Gewebe leicht Falten, wird sie schließlich in einer dünnen Schicht aus einem Hydrogel-Träger, mehr Steifigkeit und Elastizität zu geben und zu schützen während der Injektion eingebettet. Dieses Produkt wird dann bei 4 ° C bis Pfropfung gespeichert.

Protocol

Alle Menschen in diesem Protokoll verwendete Materialien wurden nach Verordnungen der Europäischen Union verwendet. Die menschliche ES-Zell-Linie, die in dieser Studie verwendeten stammt aus einem einzigartigen Embryo. Das Paar, das den Embryo gespendet hatte wurde umfassend informiert und gaben ihre Zustimmung für eine anonyme Spende. Eine klinische Grade menschliche ES Zelllinie wurde abgeleitet von diesem Embryo, überhöht, qualifiziert und ordnungsgemäß dokumentiert von Roslin Zellen (UK). Schinken wurden unter …

Representative Results

Schinken enthalten eine Epithelschicht, die entfernt werden sollten, bevor die Aussaat von RPE-Zellen. Eine enzymatische Behandlung der Membran erfolgt mit dem Thermolysin unter schütteln. In der Reihenfolge nicht, nicht verlieren die Polarität der Membran (das Epithel ist auf einer Seite), es ist fixiert auf einem Träger, welche Zusammensetzung je nach Anbieter (Abbildung 1A) unterscheiden könnte. Überprüfen Sie die Adhäsion der Membran um seine Unter…

Discussion

Wir beschrieb eine Methode für die Kultur der RPE-Zellen auf eine biologische Gerüst und deren Vorbereitung für die Implantation in Tiermodellen. Einer der kritischen Schritte des Protokolls ist die Wartung der Orientierung des Schinkens entlang des Verfahrens bis zu seiner Aufnahme in Gelatine. In der Tat, das native Epithel der Membran entfernt, und die Basalmembran wird ausgesetzt9. Die RPE-Zellen müssen auf diese Basalmembran ausgesät werden. Bei der Vorbereitung für die Einbettung von G…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren möchten Jérôme Larghero und Valérie Vanneaux (Hôpital Saint Louis, Paris, Frankreich) während der Einrichtung des hier beschriebenen Verfahrens für ihre Beiträge danken.

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem ANR [GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], der Fondation Pour la Recherche Médicale [Bioengineering Programm – DBS20140930777] und von LABEX WIEDERZUBELEBEN [ANR-10-LABX-73] Olivier Goureau und Christelle Monville. Es wurde von NeurATRIS, eine translationale Forschungsinfrastruktur (Investissements Avenir) für Biotherapies in Neurowissenschaften [ANR-11-INBS-0011] und INGESTEM, die nationale Infrastruktur (Investissements Avenir) engineering für pluripotente unterstützt und differenzierten Stammzellen [ANR-11-INBS-000], Christelle Monville. Karim Ben M’Barek wurde durch Stipendien aus DIM Stempole und LABEX WIEDERZUBELEBEN [ANR-10-LABX-73] unterstützt. -Stem ist Teil des Instituts für seltene Krankheiten, die von der Association Française Contre Les Myopathien (AFM) unterstützt Biotherapies-Téléthon.

Materials

Sterile biosafety cabinet TechGen International Not applicable
Liquid waste disposal system for aspiration Vacuubrand BVC 21
CO2-controlled +37 °C cell incubator Thermo Electron Corporation BVC 21 NT
200 µL pipette: P200 Gilson F144565
1 mL pipette: P1000 Gilson F144566
Pipet aid Drummond 75001
+4 °C refrigerator Liebherr Not applicable
Vibratome Leica VT1000S
Fine scissors WPI 501758
Forceps (x2) WPI 555227F
Water bath Grant subaqua pro SUB6
Precision balance Sartorius CP225D
Centrifuge Eppendorff 5804
Microscope Olympus SC30
Horizontal Rocking Shaker IKA-WERKE IKA MTS 214D
Vortex VWR LAB DANCER S40
Disposable Scalpel WPI 500351
plastic paraffin film VWR PM992
0.200 µm single use syringe filter SARTORIUS 16532
Syringe without needle 50 mL Dutscher 50012
Bottles 250mL Dutscher 28024
15 mL sterile Falcon tubes Dutscher 352097
50 mL sterile Falcon tubes Dutscher 352098
culture insert Scaffdex C00001N
60 mm cell culture disches: B6 Dutscher 353004
12 well cell culture plate Corning 3512
6-well culture plates Corning 3506
Razor blades Ted Pella, Inc 121-9
Cyanoacrylate glue Castorama 3178040670105
PBS 1X (500 mL) Sigma D8537
Thermolysine Roche 5339880001
DMEM, high glucose, GlutaMAX Invitrogen 61965-026
KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS) Invitrogen 12618-013
MEM-NEAA (100X) Invitrogen 11140-035
b-mercaptoethanol (50 mM) Invitrogen 31350-010
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140122
CO2-independent medium GIBCO 18045-054
Gelatin MERCK 104078
human amniotic membrane Tissue bank St Louis hospital (Paris, France) Not applicable

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Ben M’Barek, K., Habeler, W., Plancheron, A., Jarraya, M., Goureau, O., Monville, C. Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (139), e58216, doi:10.3791/58216 (2018).

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