Summary

ヒト胚性幹細胞に由来する移植適切な網膜色素上皮組織をエンジニア リング

Published: September 06, 2018
doi:

Summary

人間の羊膜と動物モデルにおける組織移植のための準備の上に培養したひと多能性幹細胞由来網膜色素上皮細胞から成る網膜組織を設計する手法を提案します。

Abstract

目の病理学の条件をいくつかの機能および/または網膜色素上皮 (RPE) の生存に影響を与えます。網膜色素変性症 (RP) と加齢に伴う黄斑変性症 (AMD) のいくつかのフォームが含まれます。細胞療法はすでに人間の予備的な結果を奨励することで、これらの病気を治すために提案された最も有望な治療戦略の一つです。ただし、移植片の作製法では、その機能的帰結in vivoが大きな影響を与える。確かに、細胞懸濁液として接ぎ木した網膜色素上皮細胞は同じ細胞網膜組織として移植より機能の低いです。ここで、エンジニア RPE 組織および生体内注入の準備簡単で再現性のある方法をについて説明します。ひと多能性幹細胞由来網膜色素上皮細胞は、生物学的サポート、ひと羊膜 (ハム) にシードされます。このサポート人工足場と比較して、内在性の網膜色素上皮細胞が接続されている、ブルッフ膜の近くにある基底膜を持っていることの利点があります。しかし、その操作は簡単ではない、適切な養殖のいくつかの戦略とin vivoの移植のための準備を行った。

Introduction

RPE は、生存と密接に関連付けられて1を光受容体の恒常性に不可欠です。その機能や生存、RP と AMD を含むいくつかの病理学の条件を変更します。

RP は、視細胞や網膜色素上皮細胞または両方2,3の機能に影響を与える継承のイネ突然変異のグループです。特に、網膜色素上皮に影響を与える突然変異細胞 RP2の 5% を占めていると推定されます。AMD は、リードの中心部に最終的に失明、網膜色素上皮層が変更される、別の条件です。AMD は、遺伝・環境要因の複雑な相互作用によって引き起こされ、高齢者4,5,6に影響を与えます。予測によると、AMD は 1 億 9600 万患者 2020年7によって世界の懸念になります。これらの疾患の効果的な治療法が存在しないと死者/機能しない既存 RPE 細胞8を補うために新しい網膜色素上皮細胞の移植は、提案された戦略の一つ。

最高の機能的な結果を確保するために接木される最終製品の定式化のモードが欠かせません。配信、簡単でわかりやすい方法であるにもかかわらず、細胞懸濁液として注入された RPE 細胞の生存、統合、および機能9,1011,12に関する懸念します。,13。 科学者は今より多くの開発を提供する複雑な製剤設計網膜組織9,13,14,,1516。この文脈では、体外で RPE 移植9使用できる組織を生成する独自の方式を開発しました。

人間の萌芽期の茎 (ES) の細胞由来網膜色素上皮細胞バンクは、このプロトコルで使用されます。ただし、代替 RPE 細胞ソース別のセル(人間誘導された多能性幹細胞、主な網膜色素上皮細胞等)から銀行と別の方法で区別されるこのプロトコルに適しています。分化が含まれているサイトカインおよび/または小さい分子17,18,19,20,21,22を使用してプロトコルします。

移植するのに設計された組織を足場に準備されるべき。過去数年間で異なる足場はポリマーまたは生物学的起源13,23,24行列に基づいて開発されました。生物基質の使用は、ハムが、裸のブルッフ膜のようなその他の基板を実装できます。記載方法は RPE のネイティブ環境に関連する生物学的足場を使用しての利点があります。

ヒト ES 細胞由来網膜色素上皮細胞は、石畳単層として完全に編成するためには、少なくとも 4 週間培養します。その段階で得られる上皮が機能と9を偏光します。最後に、この組織に容易にしわがよったようハイドロゲル キャリア注入のプロシージャの間にそれを保護するためにそれ以上の剛性と弾力性を与えるしの薄い層に埋め込まれています。この製品は、移植まで 4 ° C で保存されます。

Protocol

このプロトコルで使用されるすべての人間材料は欧州連合の規則に従って使用され。本研究で使用される人間の ES 細胞株は、ユニークな胚から派生しました。胚を寄付した人カップルは完全に知らされた、匿名の寄付のための同意を与えた。臨床グレード ヒト ES 細胞株だったこの胚由来、バンク、修飾、および適切なロスリン細胞 (イギリス) によって記載されています。ハムは、病院ガイ…

Representative Results

ハムには、網膜色素上皮細胞の播種する前に削除する必要があります上皮の層が含まれています。揺れ下サーモライシンと膜の酵素処理が実行されます。順番は (1 つの側面は上皮) 膜の極性を失う、それは組成物は、(図 1 a) プロバイダーによって異なる場合がありますサポートに固定されています。この段階でサポートする膜の密着性の確認、…

Discussion

生物学的足場とその動物モデルにおける着床に備えて網膜色素上皮細胞の培養方法について述べる。プロトコルの重要な手順の 1 つは、ゼラチンに包含まで手順に沿ってハム向きのメンテナンスです。確かに、膜のネイティブの上皮が削除され、その基底膜露出9になります。網膜色素上皮細胞は、この基底膜の上にシードする必要があります。ゼラチンを埋め込むため作成…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者は、ここで説明する方法の設定の間に彼らの入力についてジェローム ・ Larghero と Valérie Vanneaux (Hôpital サン ルイ, パリ, フランス) を感謝したいです。

この作品は、ANR からの補助金によって支えられた [GPiPS: ANR-2010-RFCS005;SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02]、財団注ぐラ凝った Médicale [バイオ工学プログラム – DBS20140930777] LABEX オリビエ Goureau、クリステル Monville [ANR 10 LABX 73] を復活させるから。NeurATRIS、トランスレーショナルリサーチ インフラストラクチャ (Investissements d’Avenir) [ANR-11-INBS-0011] 神経科学、INGESTEM、国家インフラ (Investissements d’Avenir) biotherapies の多能性のエンジニア リングに支えられ、幹細胞分化 [ANR-11-INBS-000] クリステル Monville します。カリム ベン M’Barek は、DIM Stempole と LABEX 復活 [ANR 10 LABX 73] から奨学金によって支えられました。幹 Biotherapies 協会フランセーズ contre レ Myopathies (AFM) でサポートされているまれな疾患研究所の一部である-Téléthon。

Materials

Sterile biosafety cabinet TechGen International Not applicable
Liquid waste disposal system for aspiration Vacuubrand BVC 21
CO2-controlled +37 °C cell incubator Thermo Electron Corporation BVC 21 NT
200 µL pipette: P200 Gilson F144565
1 mL pipette: P1000 Gilson F144566
Pipet aid Drummond 75001
+4 °C refrigerator Liebherr Not applicable
Vibratome Leica VT1000S
Fine scissors WPI 501758
Forceps (x2) WPI 555227F
Water bath Grant subaqua pro SUB6
Precision balance Sartorius CP225D
Centrifuge Eppendorff 5804
Microscope Olympus SC30
Horizontal Rocking Shaker IKA-WERKE IKA MTS 214D
Vortex VWR LAB DANCER S40
Disposable Scalpel WPI 500351
plastic paraffin film VWR PM992
0.200 µm single use syringe filter SARTORIUS 16532
Syringe without needle 50 mL Dutscher 50012
Bottles 250mL Dutscher 28024
15 mL sterile Falcon tubes Dutscher 352097
50 mL sterile Falcon tubes Dutscher 352098
culture insert Scaffdex C00001N
60 mm cell culture disches: B6 Dutscher 353004
12 well cell culture plate Corning 3512
6-well culture plates Corning 3506
Razor blades Ted Pella, Inc 121-9
Cyanoacrylate glue Castorama 3178040670105
PBS 1X (500 mL) Sigma D8537
Thermolysine Roche 5339880001
DMEM, high glucose, GlutaMAX Invitrogen 61965-026
KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS) Invitrogen 12618-013
MEM-NEAA (100X) Invitrogen 11140-035
b-mercaptoethanol (50 mM) Invitrogen 31350-010
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140122
CO2-independent medium GIBCO 18045-054
Gelatin MERCK 104078
human amniotic membrane Tissue bank St Louis hospital (Paris, France) Not applicable

References

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Cite This Article
Ben M’Barek, K., Habeler, W., Plancheron, A., Jarraya, M., Goureau, O., Monville, C. Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (139), e58216, doi:10.3791/58216 (2018).

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