Summary

인간 배아 줄기 세포에서 파생 된 이식 적합 한 망막 색소 상피 조직 공학

Published: September 06, 2018
doi:

Summary

망막 조직을 인간의 양수 막과 동물 모델에 이식의 준비 위에 경작 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 파생 된 망막 색소 상피 세포의 구성 하는 방법을 설명 합니다.

Abstract

눈의 여러 가지 병 적인 조건에는 기능 또는 망막 안료 상피 (RPE)의 생존에 영향을. 이러한 망막 화 (RP) 및 연령 관련 황 반 변성 (AMD)의 일부 형태를 포함합니다. 세포 치료는 이미 인 간에 있는 예비 결과 격려와 함께 이러한 질병을 치료를 제안 하는 가장 유망한 치료 전략 중 하나 이다. 그러나,는 이식의 준비의 방법의 기능적 결과 비보에 상당한 영향을 있다. 실제로, 세포 현 탁 액으로 투입 하는 RPE 세포는 망막 조직으로 이식 하는 같은 셀 보다 덜 기능적 이다. 여기, 우리 엔지니어 RPE 조직과 vivo에서 이식에 대 한 준비를 간단 하 고 재현 가능한 방법을 설명합니다. 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 파생 된 RPE 세포 생물학 지원, 인간의 양수 막 (햄)에 시드 있습니다. 인공 건설 기계에 비해,이 지원 Bruch의 막 생 RPE 세포 연결 된 가까운 지하실 막의 이점이 있다. 그러나, 그것의 조작 쉽지 않다, 그리고 우리가 그것의 적절 한 경작에 대 한 몇 가지 전략 및 준비에 비보를 접목 개발.

Introduction

RPE 생존 및 대뇌는 그것은 밀접 하 게 관련 된1의 항상성 위해 결정적 이다.입니다. 여러 가지 병 적인 조건 변경의 기능 및 생존, RP 등 AMD.

RP는 RPE 세포 또는 두2,3, 대뇌의 기능에 영향을 주는 상속된 monogenic 돌연변이의 그룹입니다. 그것은 특히 RPE에 영향을 주는 돌연변이 세포 RP2의 5 %는 추정. AMD는 다른 조건이 RPE 레이어 변경 최고의 궁극적으로 중앙 시각 손실. AMD은 유전과 환경 요인의 복잡 한 상호 작용에 의해 발생 하 고 노인4,,56에 영향을 줍니다. 계획에 따르면 AMD 20207에 의해 전세계 196 백만 환자에 대 한 우려 됩니다. 이러한 장애에 대 한 효과적인 치료법 존재 하 고 제안 하는 전략 중 하나 죽은/작동 하지 않는 기존 RPE 세포8에 대 한 보상 하기 위해 새로운 RPE 세포의 이식입니다.

투입 될 최종 제품의 배합의 모드 기능 최고의 결과 보장 하기 위해 필수적 이다. 그들의 생존, 통합 및 기능9,10,,1112 에 관한 우려를 제기 하는 RPE 세포로는 셀 서 스 펜 션, 배달, 쉽고 간단 방법 임에도 불구 하 고 주입 , 13. 과학자는 지금 개발 하 고 더 복잡 한 공식 제공 설계 망막 조직9,13,14,,1516. 이러한 맥락에서 우리는 체 외에서 RPE 조직 이식9에 사용할 수 있는 생성 하는 원래 방법 개발.

인간 미 발달 줄기 (ES) 세포에서 파생 된 RPE 세포 은행이이 프로토콜에 사용 됩니다. 그러나, 대안 RPE 세포 은행 (인간 유도 만능 줄기 세포, 기본 RPE 세포, ) 다른 셀 소스에서 다른 방법으로 분화 하 고이 프로토콜에 대 한 적절 한 있습니다. 그것은 포함 하는 감독된 차별화 cytokines 그리고/또한 작은 분자17,18,19,20,,2122를 사용 하 여 프로토콜.

이식 하는 비 계에 설계 조직을 준비 한다. 지난 몇 년 동안, 다른 건설 기계는 폴리머 또는 생물 기원13,,2324의 매트릭스에 기반으로 개발 되었다. 여기, 생물 학적 기판 사용 햄, 하지만 denuded Bruch 막 같은 다른 기판에 구현 될 수 있습니다. 여기에 설명 된 메서드는 RPE 네이티브 환경에 더 관련 된 생물 비 계를 사용 하 여 이점이 있습니다.

인간의 ES 세포 유래 RPE 세포 완전히 조약돌 단층으로 구성 하기 위해서는 적어도 4 주 동안 교양. 그 단계에서 얻은 상피 기능적 이며9편광. 마지막으로,이 조직 쉽게 주름로 그것을 한번 더 강성과 탄성 주입 절차 동안 그것을 보호 하기 위해 하이드로 겔 캐리어의 얇은 층에 포함 됩니다. 이 제품은 다음 접목까지 4 ° C에 저장 됩니다.

Protocol

이 프로토콜에 사용 되는 모든 인간의 재료 유럽 연합 규정에 따라 사용 되었다. 이 연구에 사용 된 인간의 ES 세포 라인 독특한 배아에서 파생 되었다. 부부는 배아를 기증 했다 완벽 하 게 통보 했다 고 익명 기부에 대 한 그들의 동의 주었다. 임상 등급 인간 ES 세포 라인이이 배아에서 파생 된, 틀, 자격, 되었고 제대로 문서화로 슬 린 셀 (영국)에 의해. 햄 (APHP, Hôpital 세인트루이스) 병원 지침에 ?…

Representative Results

햄은 RPE 세포의 뿌리기 전에 제거 되어야 한다 상피 층 포함. 막의 효소 치료는 떨고 아래 thermolysin와 함께 수행 됩니다. 순서 대로 하지 아니 막 (상피는 1 개의 측에)의 극성을 잃고, 그것은 어떤 구성 (그림 1A) 공급자에 따라 다를 수는 지원에 고정. 이 단계에서 그것의 지원에 막의 접착을 확인 하 고 필요한 경우 클립을 추가. 문화 삽입에 고정 시 막…

Discussion

우리는 생물 학적 비 계 및 동물 모델에 이식에 대 한 준비에 RPE 세포의 문화에 대 한 메서드를 설명합니다. 프로토콜의 중요 한 단계 중 하나는 젤라틴으로 포함 될 때까지 절차를 따라 햄의 방향의 정비 이다. 실제로, 막의 네이티브 상피 제거 되 고 그것의 지하실 막 노출된9된다. RPE 세포 지하실 막이 위에 씨앗을 품고 있다. 젤라틴을 포함 하기 위한 준비, 시 정의 된 온도에서 …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 여기 설명 하는 방법 설정 하는 동안 그들의 입력에 대 한 제롬 Larghero와 발레리 Vanneaux (Hôpital 세인트 루이스, 파리, 프랑스)에 감사 하 고 싶습니다.

이 작품은 ANR에서 교부 금에 의해 지원 되었다 [GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], Fondation 부 라 검색 Médicale [바이오 공학 프로그램-DBS20140930777] LABEX 부활 [ANR-10-LABX-73] 올리비에 Goureau와 크리스텔 Monville에서. 그것은 NeurATRIS는 변환 연구 인프라 (Investissements d’Avenir) 신경 과학 [ANR-11-INBS-0011] 및 INGESTEM, 국가 인프라 (Investissements d’Avenir)에 biotherapies에 대 한 만능 기술에 의해 지원 되었다 고 차별화 된 줄기 세포 [ANR-11-INBS-000] 크리스텔 Monville에. 카림 벤 M’Barek DIM Stempole 및 LABEX 부활 [ANR-10-LABX-73] 장학금에 의해 지원 되었다. 줄기 협회 프랑세즈 contre 레 Myopathies (AFM)에서 지 원하는 희귀 질환에 대 한 Biotherapies 연구소의 일부입니다-Téléthon.

Materials

Sterile biosafety cabinet TechGen International Not applicable
Liquid waste disposal system for aspiration Vacuubrand BVC 21
CO2-controlled +37 °C cell incubator Thermo Electron Corporation BVC 21 NT
200 µL pipette: P200 Gilson F144565
1 mL pipette: P1000 Gilson F144566
Pipet aid Drummond 75001
+4 °C refrigerator Liebherr Not applicable
Vibratome Leica VT1000S
Fine scissors WPI 501758
Forceps (x2) WPI 555227F
Water bath Grant subaqua pro SUB6
Precision balance Sartorius CP225D
Centrifuge Eppendorff 5804
Microscope Olympus SC30
Horizontal Rocking Shaker IKA-WERKE IKA MTS 214D
Vortex VWR LAB DANCER S40
Disposable Scalpel WPI 500351
plastic paraffin film VWR PM992
0.200 µm single use syringe filter SARTORIUS 16532
Syringe without needle 50 mL Dutscher 50012
Bottles 250mL Dutscher 28024
15 mL sterile Falcon tubes Dutscher 352097
50 mL sterile Falcon tubes Dutscher 352098
culture insert Scaffdex C00001N
60 mm cell culture disches: B6 Dutscher 353004
12 well cell culture plate Corning 3512
6-well culture plates Corning 3506
Razor blades Ted Pella, Inc 121-9
Cyanoacrylate glue Castorama 3178040670105
PBS 1X (500 mL) Sigma D8537
Thermolysine Roche 5339880001
DMEM, high glucose, GlutaMAX Invitrogen 61965-026
KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS) Invitrogen 12618-013
MEM-NEAA (100X) Invitrogen 11140-035
b-mercaptoethanol (50 mM) Invitrogen 31350-010
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140122
CO2-independent medium GIBCO 18045-054
Gelatin MERCK 104078
human amniotic membrane Tissue bank St Louis hospital (Paris, France) Not applicable

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Ben M’Barek, K., Habeler, W., Plancheron, A., Jarraya, M., Goureau, O., Monville, C. Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (139), e58216, doi:10.3791/58216 (2018).

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