Summary

体外分化マウス顆粒球マクロファージ ・ コロニー刺激因子 (GM-CSF)-(THGM) ヘルパー T 細胞の生産

Published: September 10, 2018
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Summary

ここで、ナイーブ cd4 陽性 T 細胞、THGM の分化の分離を含む、ナイーブ cd4 陽性 T 細胞からマウスの granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T (THGM) ヘルパー細胞を区別するためにプロトコルを提案し、THGM の分化した細胞の解析。このメソッドは、規制の研究と THGM 細胞の機能に適用できます。

Abstract

顆粒球マクロファージ ・ コロニー刺激因子 (GM-CSF)-(THGM) ヘルパー T 細胞の生産は主にインターフェロン (IFN) γ やインターロイキン (IL)-17 を伴わず GM-CSF を分泌して認められる新たに同定された T のヘルパー細胞サブセット自己免疫 neuroinflammation で重要な役割を果たします。脾細胞の単一細胞懸濁液からナイーブ cd4 陽性 T 細胞および THGM セル生成ナイーブ cd4 陽性 T 細胞からの分離の方法は、T 細胞性免疫や自己免疫疾患の研究に有用な技術でしょう。ここで IL-7 によって促進される THGM セルにマウス ナイーブ cd4 陽性 T 細胞を区別する方法をについて説明します。細胞内サイトカイン染色、フローサイトメトリー、量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) の組み合わせを含む、さまざまなテクニックを用いたサイトカイン発現の解析によって評価された分化の結果、酵素抗体法 (ELISA)。THGM 分化プロトコルをここで前述の使用細胞の約 55% はインターフェロンや IL 17 の最小表現と GM-CSF を表現しました。THGM 細胞に GM-CSF の優勢な式は、GM-CSF、インターフェロン、IL-17 mRNA とタンパク質レベルでの発現解析によってさらに確認されました。したがって、このメソッドは T にナイーブ cd4 陽性 T 細胞を区別するために使用できるHGM 細胞の in vitro、THGM 細胞生物学の研究に有用となります。

Introduction

ヘルパー (TH) cd4 T 細胞、微生物病原体に対する生体防御、癌サーベイランスおよび自己免疫1,2,3重要な役割を持つ免疫システムに不可欠なコンポーネントです。T 細胞受容体 (TCR) 活性化 THTH2 1 ナイーブ cd4 陽性 T 細胞が分化することができます、異なるサイトカイン ミリュー2,4,の影響の下で T (Treg) 細胞を TH 17、または規制5します。 最近、GM-CSF を主に生産、新しい THセルのサブセットを特定され、THGM6の名前。THGM 細胞の分化は、信号変換器の活性化と転写 5 (STAT5) の活性化を介して IL-7 によって駆動されます。これらの細胞は他の T のHの低発現しながら GM-CSF の大量を表現-署名サイトカイン肝腎と IL-176などを携帯します。GM-CSF cd 4 + T 細胞を介した neuroinflammation7,8の開発に重要な役割を果たすことがわかった。肝腎- または IL-17-を表現する自己反応性 T 細胞と比較して、GM CSF 表現 T 細胞、野生型に転送 (WT) マウス以前の発症および重症度高いです。また、 Csf2-/- T 細胞は WT の受信者に転送される利用後実験的自己免疫性脳脊髄炎 (EAE) を誘導するために失敗しました肝腎や IL 17A 欠けて T 細胞 EAE7を仲介する能力を保持するのに対し。また、中和抗体を用いた GM-CSF の封鎖は EAE 病重症度8を改善しました。さらに、マウスの T 細胞に STAT5 の欠乏は、EAE 開発6に減少 THGM 世代と、それゆえ、マウスの抵抗を起因しました。これらの調査結果は、自己免疫性アミロイド疾患における GM CSF 表現 TH細胞の重要性を強調します。したがって、ナイーブ cd4 陽性 T 細胞から GM CSF 表現 TH細胞を区別する方法を確立する自己免疫 neuroinflammation と T 細胞を介した免疫反応の機序の解明に重要となります。しかし、プロトコルを効率的にセルを生成する THGM マウス ナイーブ cd4 が確立されていないから。

ナイーブ cd4 陽性 T 細胞からマウスの THGM 細胞を区別する方法をご紹介します。このプロトコルはマウスから脾臓の抽出、TH細胞蛍光活性化セル (FACS) を並べ替え、CD4 の正の選択単一細胞懸濁液の準備などを含む全体の手順を記述します。微分法と解析。差別化されたヘルパー T 細胞は、細胞内サイトカインの mRNA レベルでのサイトカインの発現を決定する定量的リアルタイム PCR による単一細胞レベルでのサイトカインの発現をフローサイトメトリーと組み合わせて染色によって分析されるとタンパク質レベルでのサイトカインの発現を評価するために ELISA によるこのメソッドは、惹起、GM-CSF が病因に重要な役割を果たしているなど、様々 な条件の下で THGM 細胞生物学の研究に適用できます。

Protocol

このプロトコルで使用されるすべてのマウス C57BL/6 遺伝的背景、シンガポール国立大学で特定の病原体フリーの条件の下に収容します。動物介護制度とシンガポール国立大学の利用委員会によって承認されたプロトコルを使用してすべての実験を行った。 1. 試薬および材料の準備 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 2% ウシ胎児血清 (FBS) と 1 mM エチレンジアミン四酢酸 (ED…

Representative Results

2 つの 8 週齢雄 c57bl/6 マウスから分離したナイーブ cd4 陽性 T 細胞は、3 つの部分に分けられました。セルの 1 つの部分だった説明されたプロトコルを次 THGM 細胞へと分化します。別の部分を THGM の分化における IL 4 封鎖の影響をテストする抗 IL 4 抗体 (10 μ G/ml) の存在下で THGM 条件下で培養しました。最後の部分を (3 μ g/mL 抗 CD3e 1 μ g/mL 抗 CD2…

Discussion

ここで我々 は、体外THGM から分化メソッドを検証する分化した細胞の解析に続いてマウス ナイーブ cd4 細胞のプロトコルを記述しました。注記のうち、脾臓およびリンパ節はナイーブ cd4 T 細胞の浄化と THGM 分化に使えます。THGM 条件 (図 1 a) GM CSF 発現細胞になる細胞内サイトカイン染色細胞の約 55%, フローサイトメトリーと組み合わせて?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

本研究は、シンガポール国立大学健康システム (T1 ~ 2014 年 10 月 12、T1-2015 年 9 月-10) からの助成金によって支えられました。

Materials

RPMI 1640 Biowest L0500-500
FBS Heat Inactivated Capricorn FBS-HI-12A
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
10x PBS 1st Base BUF-2040-10 Diluted to 1x PBS in sterile water
EDTA 1st Base BUF-1053-100ml-pH8.0
10X ACK buffer Biolegend 420301 diluted in sterile water
cell strainer SPL Life Sciences 93070
CD4 microbeads Miltenyi Biotec 130-049-201
2-Mercaptoethanol Sigma M7522
LS column Miltenyi Biotec 130-042-401
magnetic stand Miltenyi Biotec 130-042-303
1ml syringe Terumo SS+01T
Centrifuge Eppendorf Eppendorf 5810R
Sony SY3200 cell sorter Sony Sony SY3200 cell sorter
50ml conical centrifuge tube Greiner Bio-One 210261
15m conical centrifuge tube Greiner Bio-One 188271
FACS tube Corning 352054
24 well cell culture plate Greiner Bio-One 662160
anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710 eBioscience 46-0041-82
PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55) eBioscience 12-0251-82
anti-human/mouse CD44 APC eBioscience 17-0441-82
anti-mouse CD62L FITC eBioscience 11-0621-85
Neubauer-improved counting chamber Marienfeld 640010
Hyclone Trypan Blue Solution GE healthcare Life Sciences SV30084.01
microscope Nikon Nikon Elipse TS100
Purified anti-mouse CD3e antibody Biolegend 100314
Purified hamster anti-mouse CD28 BD Biosciences 553295
Purified Rat anti-mouse IFNγ   eBioscience 16-7312-85
Purified anti-mouse IL-4 Antibody Biolegend 504102
Recombinant Mouse IL-7 Protein R&D system 407-ML
Recombinant Mouse IL-6 R&D system 406‑ML
recombinant human TGF-beta R&D system 240-B-010
PMA Merck Millipore 19-144
Ionomycin Sigma I0634
GolgiPlug protein transport inhibitor BD Biosciences 51-2301KZ
Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set eBioscience 88-8824-00
anti-mouse GM-CSF PE eBioscience 12-7331-82
FITC anti-mouse IL-17A Biolegend 506908
APC anti-mouse IFN-gamma Biolegend 505810
GO Taq qPCR master mix Promega A6002
mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! invitrogen 88-7334-88
Mouse IL-17A Uncouted ELISA invitrogen 88-7371-22

References

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Cite This Article
Lu, Y., Fu, X., Zhang, Y. In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells. J. Vis. Exp. (139), e58087, doi:10.3791/58087 (2018).

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