Summary

In Vitro Différenciation des souris Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-production de cellules T auxiliaires (THGM)

Published: September 10, 2018
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Summary

Nous présentons ici un protocole pour différencier murin granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing cellules T auxiliaires (THGM) de cellules CD4 + T naïves, notamment l’isolement des cellules CD4 + T naïves, différenciation des THGM, et analyse des cellules THGM différenciées. Cette méthode peut être appliquée aux études de la régulation et fonction des cellules THGM.

Abstract

Le granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF)-produisant des lymphocytes T helper (THGM) est un sous-ensemble de cellules d’assistance T nouvellement identifié qui principalement sécrète GM-CSF sans produire l’interféron (IFN) γ ou interleukine (IL) -17 et se trouve à jouent un rôle essentiel dans la neuro-inflammation auto-immune. Une méthode d’isolement de cellules T CD4 + naïf d’une suspension de cellules individuelles des splenocytes et génération de cellules THGM de cellules T CD4 + naïve serait une technique utile dans l’étude de l’immunité à médiation cellulaire T et maladies auto-immunes. Nous décrivons ici une méthode qui le différencie des cellules T CD4 + naïf de souris en cellules THGM promues par l’IL-7. Le résultat de la différenciation a été évalué par l’analyse de l’expression de cytokines à l’aide de différentes techniques, notamment des cytokines intracellulaires coloration combinée avec la cytométrie en flux, une quantitative PCR en temps réel (PCR), et dosages immuno-enzymatiques (ELISA). Utilisant le protocole de différenciation THGM comme décrit ici, environ 55 % des cellules exprimé GM-CSF avec une expression minimale d’IFNα ou IL-17. L’expression prédominante de GM-CSF par les cellules THGM a été confirmée par l’analyse de l’expression du GM-CSF, IL-17 niveaux d’ARNm et protéines et IFNα. Ainsi, cette méthode peut être utilisée pour différencier les cellules T CD4 + naïf à THGM cellules in vitro, qui sera utile dans l’étude de la biologie cellulaire THGM.

Introduction

Cellules CD4 + T auxiliaires (TH) sont des éléments essentiels du système immunitaire, ayant un rôle crucial dans la défense de l’hôte contre les agents pathogènes microbiens, dans la surveillance du cancer et l’auto-immunité1,2,3. Lors de l’activation de récepteur (TCR) de lymphocytes T, cellules T CD4 naïves peuvent être différenciés en TH1, TH2, TH 17, ou réglementaires T (Treg) cellules sous l’influence de cytokines différents milieux2,4, 5. récemment, un sous-ensemble de nouveau des cellules TH , qui produit principalement des GM-CSF, a été identifié et nommé THGM6. La différenciation des cellules THGM est entraînée par l’IL-7 par le biais de l’activation d’un transducteur de signal et un activateur de transcription 5 (STAT5). Ces cellules expriment une grande quantité de GM-CSF tout en ayant une faible expression des autres TH-cell signature cytokines telles que l’IFNγ et IL-176. GM-CSF s’est avéré jouent un rôle essentiel dans le développement de CD4 + T cell-mediated neuroinflammation7,,8. Par rapport à IFNγ ou IL-17-exprimant des cellules autoréactives T, T exprimant le GM-CSF cellules transférés à sauvage souris (WT) faits une apparition précoce de la maladie et la gravité de la maladie. En outre, les cellules de T de Csf2– / – n’a pu induire encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) après avoir été transféré Moutschen aux destinataires WT, tandis que les cellules T dépourvues d’IFNγ ou IL-17 a conservé la capacité de provoquer des EAE7. En outre, un blocus de GM-CSF à l’aide d’anticorps neutralisants amélioré EAE maladie gravité8. En outre, une carence de STAT5 dans les cellules T chez les souris a entraîné dans une génération THGM diminuée et, partant, à une résistance des souris EAE développement6. Ces résultats soulignent l’importance des lymphocytes T exprimant le GM-CSFH de maladie auto-immune thérapeutiques. Ainsi, en établissant une méthode pour différencier les cellules T exprimant le GM-CSFH de cellules T CD4 + naïve serait important dans l’étude de la pathogenèse de la neuro-inflammation auto-immune et immunité à médiation cellulaire T. Toutefois, un protocole qui efficacement génère des cellules THGM de murin naïf que CD4 + n’a pas été établi.

Nous présentons ici une méthode qui se différencie des cellules THGM de cellules T CD4 naïves. Ce protocole décrit l’ensemble de la procédure, y compris l’extraction de la rate de la souris, la préparation d’une suspension de cellules individuelles, la sélection positive de CD4, la cellule activée par fluorescence triant (FACS) et la cellule TH différenciation et l’analyse. Lymphocytes T helper différenciés sont analysés par cytokine intracellulaire coloration combinée avec écoulement cytometry pour déterminer l’expression de cytokines au niveau unicellulaire, par une PCR quantitative en temps réel afin de déterminer l’expression de cytokines au niveau de l’ARNm, et par ELISA pour évaluer l’expression de cytokines au niveau de la protéine. Cette méthode peut être appliquée aux études de biologie cellulaire THGM dans diverses conditions, telles que EAE, où GM-CSF joue un rôle important dans la pathogenèse.

Protocol

Toutes les souris utilisées dans le présent protocole ont été sur le bagage génétique de C57BL/6 et logés dans des conditions spécifiques à la National University of Singapore exempts de micro-organismes pathogènes. Toutes les expériences ont été effectuées à l’aide de protocoles approuvés par le Comité de l’urbanisme de l’Université nationale de Singapour et d’institutionnels animalier. 1. réactif et préparation du matériel Préparer 500 mL d’une solut…

Representative Results

Les cellules T CD4 + naifs isolées de deux souris C57BL/6 mâles de 8 semaines ont été divisés en trois parties. Une portion des cellules est différenciée en suivant le protocole décrit les cellules THGM. Une autre partie a été cultivée dans des conditions THGM en présence d’anticorps anti-IL-4 (10 µg/mL) pour tester l’influence d’un blocus de l’IL-4 dans la différenciation des THGM. La dernière partie a été cultivée dans un état …

Discussion

Ici, nous avons décrit un protocole d’une différenciation de THGM in vitro de cellules de souris naïves CD4 +, suivie d’une analyse des cellules différenciées pour valider la méthode. À noter, rate et les ganglions lymphatiques peut être utilisés pour naïve purification de cellules T CD4 + et différenciation THGM. L’expression de cytokines déterminée par cytokine intracellulaire coloration combiné avec écoulement cytometry a montré qu’environ 55 % des cellules ont é…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été financée par des subventions de l’Université nationale santé système de Singapour (T1-2014 Oct-12 et T1-2015 Sep-10).

Materials

RPMI 1640 Biowest L0500-500
FBS Heat Inactivated Capricorn FBS-HI-12A
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
10x PBS 1st Base BUF-2040-10 Diluted to 1x PBS in sterile water
EDTA 1st Base BUF-1053-100ml-pH8.0
10X ACK buffer Biolegend 420301 diluted in sterile water
cell strainer SPL Life Sciences 93070
CD4 microbeads Miltenyi Biotec 130-049-201
2-Mercaptoethanol Sigma M7522
LS column Miltenyi Biotec 130-042-401
magnetic stand Miltenyi Biotec 130-042-303
1ml syringe Terumo SS+01T
Centrifuge Eppendorf Eppendorf 5810R
Sony SY3200 cell sorter Sony Sony SY3200 cell sorter
50ml conical centrifuge tube Greiner Bio-One 210261
15m conical centrifuge tube Greiner Bio-One 188271
FACS tube Corning 352054
24 well cell culture plate Greiner Bio-One 662160
anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710 eBioscience 46-0041-82
PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55) eBioscience 12-0251-82
anti-human/mouse CD44 APC eBioscience 17-0441-82
anti-mouse CD62L FITC eBioscience 11-0621-85
Neubauer-improved counting chamber Marienfeld 640010
Hyclone Trypan Blue Solution GE healthcare Life Sciences SV30084.01
microscope Nikon Nikon Elipse TS100
Purified anti-mouse CD3e antibody Biolegend 100314
Purified hamster anti-mouse CD28 BD Biosciences 553295
Purified Rat anti-mouse IFNγ   eBioscience 16-7312-85
Purified anti-mouse IL-4 Antibody Biolegend 504102
Recombinant Mouse IL-7 Protein R&D system 407-ML
Recombinant Mouse IL-6 R&D system 406‑ML
recombinant human TGF-beta R&D system 240-B-010
PMA Merck Millipore 19-144
Ionomycin Sigma I0634
GolgiPlug protein transport inhibitor BD Biosciences 51-2301KZ
Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set eBioscience 88-8824-00
anti-mouse GM-CSF PE eBioscience 12-7331-82
FITC anti-mouse IL-17A Biolegend 506908
APC anti-mouse IFN-gamma Biolegend 505810
GO Taq qPCR master mix Promega A6002
mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! invitrogen 88-7334-88
Mouse IL-17A Uncouted ELISA invitrogen 88-7371-22

References

  1. Zhu, J., Paul, W. E. CD4 T cells: fates, functions, and faults. Blood. 112, 1557-1569 (2008).
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Cite This Article
Lu, Y., Fu, X., Zhang, Y. In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells. J. Vis. Exp. (139), e58087, doi:10.3791/58087 (2018).

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