Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Opprettholde biologisk kulturer og måle byggkorn under Aphis nerii: en ikke-modellsystem for plante-insekt interaksjoner

Published: August 31, 2018 doi: 10.3791/58044
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biological Sciences Department, Vanderbilt University

Summary

Bladlus Aphis nerii colonizes på svært forsvarte planter i familien dogbane (Apocyanaceae) og gir mange muligheter til å studere plante-insekt interaksjoner. Her presenterer vi en rekke protokoller for vedlikehold av anlegg og bladlus kulturer, og generasjon og analyse av molekylære og - omic data for A. nerii.

Abstract

Bladlus er utmerket eksperimentelle modeller for en rekke biologiske spørsmål fra utviklingen av symbioses og utvikling av polyphenisms til spørsmål omkring insekt interaksjon med deres Salix. Genomic ressurser er tilgjengelige for flere bladlus arter, og med fremskritt innen neste generasjons sekvensering, transcriptomic studier utvides til ikke-modellen organismer som mangler genomer. Bladlus kulturer kan videre, samlet fra feltet og oppdratt i laboratoriet for bruk i organismebiologi og molekylære eksperimenter for å bygge bro mellom økologiske og genetiske studier. Sist, mange bladlus kan opprettholdes i laboratoriet på foretrukne vert plantene i evigvarende, parthenogenic sykluser slik at sammenligninger av asexually gjengivelse genotyper. Aphis nerii, milkweed-oleander bladlus, gir en slik modell for å studere insekt interaksjon med giftige planter ved hjelp av både organismebiologi og molekylære eksperimenter. Metoder for generasjon og vedlikehold av anlegg og bladlus kulturer i drivhus og laboratory, DNA og RNA utdrag, mikrosatellittmarkør analyse, de novo transcriptome montering og merknaden, transcriptome differensial uttrykket analyse og qPCR verifikasjon av ulikt uttrykt gener er beskrevet og diskutert her.

Introduction

Bladlus er liten, hemimetabolous insekter som koloniser på ulike anlegg familier over hele verden. De er karakteristiske for flere funksjoner, mest spesielt komplekse livssyklusen med syklisk Partenogenese og diskret polyphenisms, og deres forplikte ernæringsmessige symbioses med bakteriell eller gjær endosymbionts som leverer næringsstoffer mangler kostholdet anlegget sap1. Mens de fleste bladlus vert anlegg spesialister, noen generalist arter er viktig avling skadedyr, påførte betydelig økonomisk skade på avlinger enten direkte eller via patogener og virus vektor de2. Utgivelsen av det første bladlus genomet i 2010, ert bladlus Acyrthosiphon erter3, markerte en viktig milepæl i studiet av bladlus biologi fordi det ga genomisk ressursene for adressering spørsmål om insekt tilpasninger til planteetende livsstil, inkludert de som kan føre til en bedre kontroll strategier4. Siden den gangen akkumulert genomisk tilleggsressurser med utgivelsen av en annotert genomet for soyabønner bladlus Aphis glycines5og offentlig tilgjengelig hele genomet ressurser for en tre-bladlus Art (Myzus cerasi (black cherry bladlus), Myzus persicae (fersken-potet bladlus), Rhopalosiphum padi (Hegg-katt bladlus)6. Verdifulle de novo transcriptomic ressurser er tilgjengelige i tillegg til en rekke andre bladlus arter (e.g.,Aphis gossypii (bomull bladlus) Sitobion avenae (korn bladlus)8, Cinara pinitabulaeformis (furu bladlus)9, Aphis nerii (milkweed-oleander bladlus)10).

Bladlus har også gjort varig bidrag til vår forståelse av plante-insekt interaksjoner og økologi av livet på planter11. Et område der bladlus har gjort spesielt viktig bidrag er i vår forståelse av kjemiske økologi av verten anlegget interaksjoner. Planteetende insekter uttrykke ulike tilpasninger fordel for overvinne plante forsvar, og noen enda co-opt anlegget forsvar for sin egen12,13,14. Milkweed-oleander bladlus, Aphis nerii, er for eksempel en lys gul, invasiv bladlus i tempererte og tropiske regioner over hele verden som colonizes på planter i milkweed familien (Apocynaceae). Planter i familien Apocynaceae utviklet seg ulike kjemiske forsvar, inkludert melkeaktig latex og cardiac glykosider kjent som cardenolides, som binder kasjon transportøren Na, K-ATPase og effektiv deterrents å generalist planteetere15, 16. milkweed spesialister express forskjellige moduser av motstand mot cardenolides og noen selektivt eller passivt samle eller endre cardenolides av vev å avskrekke predasjon eller andre fordeler17. A. nerii er tenkt å beslaglegge cardenolides på denne måten, selv om de mekanismer og funksjonelle fordelene fortsatt uklart10,18.

Gitt genomisk ressursene for hånden, gir A. nerii en utmerket eksperimentell modell for studiet av molekylære og genetiske mekanismer involvert i kjemoterapi-økologiske samspillet mellom giftige vert planter og deres spesialist planteetere. Det er verdt å merke seg at mens noen av de tidligste studiene av A. nerii fokusert på lagring cardenolides19, siden den gangen har studier av A. nerii har gitt innsikt i et bredt spekter av evolusjonære og økologiske spørsmål, inkludert den genetiske strukturen av invasiv insekter20 og samspillet mellom opp- og topp-ned regulering på herbivore tetthet21. A. nerii er således en god kandidat som en eksperimentell modell for en spesielt lang rekke studier av insekt-plant interaksjoner. Kritisk for at enhver studie med A. nerii er forsiktig kultur bladlus befolkninger, som inkluderer kultur planter som bladlus avhenger, samt en effektiv generasjon av høy kvalitet - omic data. Vårt mål er å lede leseren gjennom både. Skissert nedenfor er metoder for generasjon og vedlikehold av anlegg og bladlus kulturer i drivhus og laboratorium, DNA og RNA utdrag, mikrosatellittmarkør analyse, de novo transcriptome montering og merknaden, transcriptome differensial uttrykk analyse og qPCR verifikasjon av ulikt uttrykt gener. Mens disse metodene er skrevet for A. nerii, generell dyrking, utvinning, og analyseteknologi kan utvide til en rekke bladlus arter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. anlegget kulturer

  1. Kjøpe frø fra en kommersiell leverandør eller samle fra modne planter i feltet.
    Merk: Denne protokollen er egnet for de fleste kommersielt tilgjengelige milkweed arter (f.eks Asclepias incarnata, A. syriaca, A. curassavica, Gomphocarpus physocarpus). Noen frø må være kaldt-lagdelt, og instruksjoner fra frø leverandør bør sjekkes.
  2. Plante frø i en fin germinating jord (60-70% fine torv moss, perlitt, vermikulitt, kalkstein).
    1. Fylle en standard frøplante brett med spiring blanding jord; sikre at jorden når toppen av brønnene. I hver brønn, gjør et innrykk å lage et hull i jorda om 3 cm dyp.
    2. Plass ett frø i hvert hull og vann godt med en vannkanne slik at jord dekker frø og er mettet.
    3. Vokse frøene i drivhus (se betingelser nedenfor, 1,5). Vann regelmessig, daglig til hver-annen-dag; nok til å opprettholde jordfuktighet til et moderat nivå.
  3. Når seedlings har vokst sitt første sett med full blader, nytt pott planter en generell potting mix (50 – 60% torv moss, bark og kalkstein) (figur 1A).
    1. Bruke 4-tommers runde Potter som passer med en tett forsegling med cup merdene. Fyll med generelle potting jord opp til ca 5 cm under kanten.
    2. Lage et hull i jorda dypt nok til å nå bunnen av potten.
    3. Med hånden, forsiktig scoop modne frøplante fra vel og plassere den dypt inne hullet i 4 tommers potten. Dekk frøplante med jord. Vann godt.
    4. Dyrke planter i drivhus og vann regelmessig, daglig til annenhver dag; nok til å opprettholde moderat jordfuktighet.
  4. Drivhus forhold.
    1. Angi drivhus Termostatene å opprettholde Dagtid temperaturer mellom 18-28 ° C og natt temperaturer mellom 16-22 ° C bruke instruksjonene fra produsenten.
    2. I vintermånedene når dagene blir kortere, supplement dagslys med 600 W høytrykks natrium pærer (12 h, 8 am-8 pm).
  5. Kontrollere uønskede skadedyr (f.eks Trips, bladlus) med en foliar organiske såpeløsning, men, bruke disse produktene med forsiktighet.
    1. Gjør såpevann etter produsentens anbefaling og bruk ved hjelp av en sprayflaske.
    2. La såpe på planter for 4-24 h. forsiktig rense planter med vann for å fjerne såpe 4-24 h etter programmet, og skyll med vann en andre gang før bruk med laboratoriet bladlus kulturer.
  6. Kultur gjennomsnittlig bladlus befolkningen på planter som har vokst minst 3-4 sett med full blader og er minst 10 cm høy (figur 1B).

2. bladlus kulturer

  1. Start laboratorium bladlus befolkningen fra en eksisterende lab isoclonal befolkning eller starte fra feltet samlet bladlus følge instruksjonene nedenfor.
    1. Når du starter et laboratorium befolkningen fra en eksisterende lab isoclonal befolkning, overføre bladlus som beskrevet i 2.3.1–2.3.3.
  2. Når begynner den nye isoclonal, feltet samlet bladlus bestander og plassere en enkelt, reprodusere, voksen bladlus på egnet næringsplante som nevnt i trinn 1.6.
    Merk: Befolkninger kan startes fra vinger (alate) eller unwinged (apterous) voksne.
    1. Undersøke manuelt planter fra drivhuset for uønskede skadedyr før bruk med laboratoriet bladlus. Fryse alle planter med uønsket bladlus. Eventuelt kan du bruke en etanol vakuum kolbe fjerne Trips eller andre skadedyr.
      Merk: Husk å skylle planter som har blitt behandlet med såpe før bruk som beskrevet i trinn 1.5.2.
    2. Trygt overføre en enkelt voksen bladlus ved hjelp av en pensel eller en munn pipette opprettet med 3/16" ID x 1/4" OD plast slangen, en 1000 µL pipette tips og en 2,00 µL pipette tips (figur 2A).
    3. Sikkert dekke planter med bladlus med en kopp bur laget med en plast kopp med toppen avskåret, dekket med en finmasket og sikret med tape (figur 2B).
    4. Plasser bladlus-infested planter i en skuff og holde i et kontrollert miljø kammer (16 L: 8D, 22 ° C, 70% fuktighet).
  3. For å opprettholde de lager befolkningene, overføre bladlus friskt, nytt anlegg ukentlig (2.2.1–2.2.3).
    1. Overføre trygt 1 – 3 2nd eller 3rd skikkelsen nymfer og 1 voksen-alderen bladlus bruker en munn pipette (tall 2A, 3).
      Merk: Aksjer vedlikeholdes best ved å overføre unwinged personer.
    2. Sikkert dekke bladlus-infested planter med en kopp bur laget med en plast kopp med toppen avskåret, dekket med en finmasket og sikret med tape.
    3. Plasser planter i en skuff og holde bladlus i en miljømessig kammer (16 L: 8D, 22 ° C, 70% fuktighet).
    4. Alternativt, hvis ønsket og hvis verten anlegget er anstendig kvalitet, bruk en etanol vakuum kolbe for å redusere populasjoner forlate eneste gjengivelse voksen og to til tre 2nd eller 3rd skikkelsen nymfer.
  4. For å opprette samme alder populasjoner for bruk i eksperimenter, plasserer du opptil 5 voksne (helst unwinged) fra lager befolkningen på nye næringsplante.
    1. Fjern voksne 24 timer senere.
    2. Ca 5-7 dager senere, plassere når F1 avkom har modnet til voksen, opptil 5 unwinged F1 voksne på nye næringsplante. Fjern voksne 24 timer senere.
    3. Når F2 befolkningen har modnet til voksen, er denne befolkningen klar til å brukes i eksperimenter.
      Merk: Denne prosessen sikrer at eksperimentelle befolkningen er omtrent samme alder og er født av omtrent samme alder mødre.
  5. Bekrefte genotypic forskjellene mellom feltet-fanget isoclonal linjer med mikrosatellittmarkør genotyperingteknologi (beskrevet nedenfor, avsnitt 3 og 4).

3. DNA utvinning

  1. Forberedelse
    1. Bruke sterilt teknikker for å forberede 1 L lyseringsbuffer (0.1 M NaCl, 0,2 M sukrose, 0.1 M Tris (pH 9.1), 0,05 M EDTA, 0,05% SDS).
    2. Varme oppvarming blokk eller vann bad til 65 ° C.
  2. Vev homogenisering og lyseringsbufferen
    1. Plass bladlus nederst i et sterilt, 1,5 mL microcentrifuge rør.
    2. Plasser den sterile pistil i røret med bladlus og senk bunnen av røret i flytende nitrogen.
      Merk: Optimal vev oppløsning oppnås når bladlus plasseres mellom pistil og siden av røret.
    3. Grind i bladlus med støter til utgangspunktet lyse cellene.
    4. For en enkelt voksen bladlus, bruk 200 µL (delt i 2 x 100 µL dele) av lyseringsbuffer. Legge til den første aliquot å male og resuspend den knuste bladlus inntil prøven er synlig oppløst, og bruk den andre aliquot for å vaske pistil.
    5. Inkuber knust bladlus i lyseringsbuffer på 65 ° C i vann bad eller varme blokken i 30 min.
  3. DNA nedbør
    1. Røret er varm, legger du til 14 µL av 8 M KOAc. Invertere røret å blande. Lagre prøven på is 30 min.
      Merk: Protokollen kan pauses her og prøver kan lagres på 20 ° C til 24 timer.
    2. Sentrifuge 13.000 x g i 15 min ved romtemperatur. Overføre nedbryting til ny 1,5 mL tube med en pipette. Pass på at du ikke fjerner pelleted rusk.
    3. For å forbedre DNA pellet visualisering, legge til 2 µL glykogen (20 µg/mL) nedbryting. Hvis utvalgsstørrelsen er stort nok, Utelat dette trinnet.
    4. Legge til 200 µL av kaldt 100% molekylær-grade etanol nedbryting. Invertere rør for å mikse og ruge ved romtemperatur i minst 15 min.
      Merk: Protokollen kan pauses her og prøver kan lagres på 20 ° C til 24 timer.
    5. Sentrifuge 13.000 x g i 15 min ved romtemperatur. Fjerne etanol ved pipettering.
  4. DNA vask og elueringsrør
    1. Legge til 200 µL av kaldt 70% molekylær-grade etanol. Deretter Bla røret for å resuspend og vaske pellet.
    2. Sentrifuger 13.000 x g i 5 min. Mens visualisere pellet, nøye fjerne etanol ved pipettering og legge 200 µL av kaldt 100% molekylær-grade etanol.
    3. Sentrifuger 13.000 x g i 5 min. Mens visualisere pellet, forsiktig fjerne etanol av pipettering.
      Merk: Gjenta 100-70-100 etanol vask om nødvendig.
    4. Luften tørr pellets for 5-10 minutter med t legging vannrett åpen på et papir.
    5. Resuspend DNA pellet i 80 µL av lav TE (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA).
    6. Kvantifisere resuspended DNA bruker et spektrofotometer.
    7. Butikken på 4 ° C.

4. mikrosatellittmarkør PCR og sekvenser for bladlus genotyperingteknologi

  1. Bestill de passende F og R primerne for mikrosatellittmarkør sekvensering (tabell 120).
    Merk: Omvendt primer sekvenser bør endres med 5-6-FAM eller 5-5-HEX fluorescerende etiketter å tillate multiplex prøver for mikrosatellittmarkør sekvenser.
  2. Utføre PCR med enkelt bladlus DNA-prøver (beskrevet i kapittel 3) og fluorescently merket mikrosatellittmarkør primere.
    1. Bland PCR reaksjoner ifølge produsentens protokollen (0,2 µM F/R primer, 2,5 MgCl2, 50-200 ng DNA mal).
    2. Bruk følgende thermocycler innstillinger: første rødsprit ved 94 ° C i 4 min, 35 sykluser av 94 ° C for 30 s, 58 ° C i 35 s, 72 ° C i 45 s, og et siste forlengelse skritt ved 72 ° C i 10 min.
  3. Kombiner PCR prøver med ulike fluorescerende koder å redusere antall utdrag rekkefølge og sekvens mikrosatellittmarkør eksemplene på et genotyperingteknologi anlegg.
  4. Analysere .fsa rå prøven filer ved hjelp av mikrosatellittmarkør analyseprogramvare.

5. RNA utvinning

  1. Bladlus prøver for RNA utvinning i 1,5 mL RNase / DNase-fri rør og umiddelbar fryse i flytende nitrogen.
    Merk: Hvis følgende ikke utføres umiddelbart, prøvene kan lagres på-80 ° C.
  2. Vev homogenisering
    1. Med den sterile støter i røret med bladlus, fryse i flytende nitrogen i 10-15 sekunder, til eksempel stopp sizzling. Knuse bladlus godt med støter som beskrevet i trinn 3.2.
      Merk: Optimal vev oppløsning oppnås når bladlus plasseres mellom pistil og siden av røret.
    2. I avtrekksvifte, legge til 800 µL av guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform utvinning reagensen prøven (1 – 5 voksne bladlus). Homogenize prøver med pistil og kast pistil.
  3. Fase separasjon
    Merk: Alle trinnene bør utføres i avtrekksvifte.
    1. Inkuber homogenisert prøvene i 5 minutter ved romtemperatur. Legge til 160 µL av kloroform utvalg. Rist kraftig for hånd for 15 s.
    2. Inkuber i 2-3 min i romtemperatur. Sentrifuger i 15 min 12 000 x g på 4 ° C.
      Merk: Etter sentrifugering, blandingen skiller i 3 lag: en lavere, rød fenol-kloroform fase, en interphase og en fargeløs øvre vandige fasen. RNA forblir i den vandige fasen. Volumet av den vandige blir ~ 480 µL.
  4. RNA nedbør
    1. I avtrekksvifte, overføre den vandige fasen slik frisk, RNase-fri. Ikke forstyrr mellomliggende fasen.
    2. Utløse RNA ved å legge til 400 µL av isopropanol og ruge prøven på 20 ° C i 10 min.
      Merk: Protokollen kan pauses her og prøver kan lagres på 20 ° C til 24 timer.
    3. Sentrifuge utvalget for 10 min 12 000 x g på 4 ° C.
  5. RNA vask og elueringsrør
    1. Fjerne nedbryting; se for RNA-pellets.
    2. Vask RNA pellets med 1 mL av 75% etanol i DEPC-behandlet vann. Bland ved langsom vortexing. Sentrifuge for 5 min 7500 x g på 4 ° C.
    3. Gjenta trinn 5.5.1–5.5.2 å fjerne fenol forurensninger.
    4. Fjern nedbryting og lufttørke pellet for 5-10 min med rør legging vannrett åpne på en steril benk. Ikke la RNA pellet tørke helt.
    5. Oppløse RNA pellet i 30 µL RNase-free eller DEPC-behandlet vann. Pipetter forsiktig opp og ned for å blande. Ruge på 55-60 ° C i 10-15 min.

6. RNAseq De Novo Transcriptome montering, merknader og differensial uttrykk analyse

  1. Analysere RNA eksempel konsentrasjonen og kvaliteten med en chip-baserte kapillær electrophoretic system.
    Merk: En chip-baserte kapillært geleelektroforese system er foretrukne valg enn analysere med et spektrofotometer fordi det gir et mer nøyaktig og følsom mål RNA konsentrasjonen og kvaliteten.
    1. Hvis utvalgene er av egnet kvalitet (≥ 250 ng totalt, RIN (RNA integritet nummer) ≥ 5), utføre RNA sekvensering.
      Merk: Viktigere, fordi sekvensering dataene vil bli brukt for både expression profilering og de novo transcriptome montering, mer lese dybden vil resultere i en høyere kvalitet transcriptome. For en rimelig omfattende samling med Illumina sekvensering teknologi, 100-200 millioner 100 bp, ville sammenkoblede slutten leser være anbefalte utgangspunkt. Totalt mRNA biblioteket forberedelse og RNA sekvensering ble utført av en sekvensering anlegget.
  2. Sjekk kvaliteten på leser bruker rask QC22.
  3. Kombiner alle prøve leser og samle transcriptome de novo med Trinity23,24 (Trimmomatic kvalitet filtrering aktivert).
  4. Fornye samlingen
    1. Bruk Transdecoder25 å identifisere åpent lesing rammer (ORFs) som er minimum 100 aminosyrer i lengde.
    2. Utføre homologi søker etter de oversatte ORFs mot Pfam26 og UniProt27 databaser med BLASTP28 og HMMER29, henholdsvis.
    3. Fjerne bakteriell transkripsjoner (en oversatt sekvens som beste EKSPLOSJONEN rammet var å en bakteriell genet med en bit score på over 300 og en minimum aminosyre sekvens identiteten til 50%).
    4. Skjule en komplett, oversatt ORFs som er minst 99% identiske på aminosyre nivå ved hjelp av CD-HIT30.
    5. Skjule de gjenværende, ufullstendige ORFs som er minst 95% identiske på nukleotid nivå ved hjelp av CD-HIT30.
    6. Tilordne den gjenværende nukleotid sekvenser med unike, artsspesifikke identifikatorer (eksempelvis APHNE 0001).
  5. Vurdere fullstendigheten av raffinerte samlingen, bruker tapet (http://busco.ezlab.org/) og Arthropoda gene dataset31.
  6. Transcriptome merknad
    1. Først kommentere den raffinerte transcriptome bruker HMMER mot Pfam databasen26,29.
    2. Andre kommentere transcriptome bruker BLASTP mot UniProt databasen27,28.
    3. Tredje, kommentere transcriptome bruker BLASTP mot koding sekvenser av valgte insekter med publisert, kommenterte genomer.
    4. Sist, kommentere transcriptome bruker BLASTP mot ert bladlus protein databasen bare.
    5. Bruk Trinotate til å generere gå merknader fra UniProt tiltredelser.
    6. Bruk Trinotate til å organisere alle merknader resultatene i en SQLite database og generere en merknad-rapport.
  7. Differensial uttrykk analyse
    Merk: Bruker den raffinerte transcriptome som referanse, justere og kvantifisere hvert bibliotek separat.
    1. Bruk Trimmomatic til kvalitet-filter og trim originalen lese filer32.
      Merk: Hvis dette grepet etter en Trinity montering en kan i stedet bruke Trimmomatic utdataene fra trinn.
    2. Utføre lokale justeringer for hvert utvalg bruker Bowtie233.
    3. Pakk ut Les teller fra hvert utvalg med SAMtools34.
    4. Beregne differensial uttrykket mellom eksempler rundt DESeq2 med standardparametere og en parametrisk passe35.

7. qPCR verifikasjon av ulikt uttrykt gener

Merk: Hvis brukerne er interessert i narkotikalovgivningen uttrykt gener fra sine RNAseq eksperimenter, følgende protokollen kan brukes til å kontrollere mønstre av differensial uttrykk.

  1. Generere RNA prøver som beskrevet ovenfor (trinn 5).
  2. Quantitate RNA utdrag med et spektrofotometer sjekke for kvalitet og få konsentrasjonen.
  3. Syntetisere cDNA prøver ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig utstyr som produsentens anbefaling.
  4. Bestemme primer-effektivitet for gener av interesse å sikre nøyaktige todelt PCR forsterkning.
    1. Basert på opprinnelige RNA konsentrasjoner, utføre føljetong fortynninger (101) å få 3 cDNA konsentrasjoner.
    2. Bruker en kvantitativ PCR master blanding, blanding tre eksemplarer qPCR reaksjoner etter produsentens protokoll tre primer konsentrasjoner (f.eks 100 nM, 200 nM, 300 nM) med tre serielt utvannet cDNA konsentrasjoner (f.eks 0,1 ng/µL, 10 ng/µL, 100 ng/µL).
    3. For hvert mål genet, beregne stigningstallet (m) linjen opprettet med mener Ct verdiene for hver prøve avhengig av variabler og loggen (cDNA konsentrasjon) som de uavhengige variablene (tre poeng totalt).
    4. Bruke denne formelen til å beregne primer effektiviteten (E) hvor m er stigningstallet beregnet i 7.4.3:
      E = 10^(-1/m)
      Merk: Primer-effektivitet mellom 90-110% er egnet for analyser. Denne prosessen sikrer like forsterkning av alle gener i beregningene.
  5. Bruke metoden ΔΔCt med et housekeeping gen for å kvantifisere differensial uttrykket for gener av interesse36.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Plante kulturer: Frø vil ta omtrent to til fire uker, avhengig av sesongen, for å vokse stort nok til å være re-puttet (figur 1A). Re-Potted planter vil ta ytterligere to til fire uker å vokse til en optimal størrelse for bladlus kulturer (figur 1B).

Bladlus kulturer: Voksen A. nerii kjennetegnes av noen mørkere cauda og kan være unwinged (apterous, Figur 3A, B) eller vinger (alate, Figur 3C, D). Utvikle fløyen pads blir synlige når nymfer når den tredje skikkelsen (Figur 3E, F). Lager kulturer vedlikeholdes best ved å overføre en til tre midt skikkelsen og en voksen-alderen unwinged bladlus; Dette sikrer en sunn, blandet alder befolkningen. Populasjoner som skal brukes for eksperimenter bør bli kultivert med unwinged bladlus som beskrevet ovenfor (2,4). En A. nerii voksen kan produsere 3-10 avkom per dag, avhengig av verten anlegget og bladlus10år.

DNA og RNA utdrag: Enkelt, voksen A. nerii vil gi ca 100-200 ng/µL DNA (80 µL elueringsrør; Figur 4 A) og 150-300 ng/µL RNA (30 µL elueringsrør; Figur 4 B). representant mikrosatellittmarkør topper er vist i figur 5. Representant relative uttrykk med et kandidat under tre forhold (kontroll, behandling 1, behandling 2) beregnes i tabell 2 og vist i figur 6.

Figure 1
Figur 1 : Representant planter for bladlus kulturer. (A) Seedlings kan bli re-Potted etter at de har utviklet sin første komplett sett med ekte blader. (B) planter kan brukes for bladlus kulturer når de har utviklet 3-4 sett med ekte blader. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Eksempler på redskaper for dyrking bladlus. (A) munnen Pipetter kan opprettes ved hjelp av 3/16" ID x 1/4" OD plast slangen, en 1000 µL pipette tips og en 200 µL pipette tips. (B, C) Bruk kopp bur (klar plast kopper med toppen avskåret og sikret med finmasket) sikkert passer over toppen av 4 tommer som ble brukt til bladlus kulturer. Dette gir rikelig lys og ventilasjon å skape et egnet miljø for bladlus og plante, og holder bladlus inneholdt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Representant voksne og nymfen Aphis nerii. (A, B) Apterous (unwinged) voksen A. nerii identifiseres av mørke cauda på bakre ende. (C, D) Alate (bevingede) voksne er identifisert av fullt utviklet vinger og formørket cauda på deres bakre. (E, F) Utvikle A. nerii nymfer gå gjennom fire skikkelsen og utvikle fløyen pads bli tydelig under tredje skikkelsen scenen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Representant gels. (A) DNA utdrag (1 kb stiger). Syv A. nerii DNA utdrag kan visualiseres i baner 3-9. Negativ kontroll er i lane 10. (B) RNA utdrag. Elleve A. nerii RNA utdrag kan visualiseres i baner 3-13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Representant mikrosatellittmarkør topper. 6-FAM-merket topper er visualisert i blått. LIZ-500 stigen vises i oransje. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : qPCR bekreftelse med et ulikt uttrykte. Representant mRNA relative antallet (RQ) uttrykk (beregnet ved hjelp av ΔΔCt metoden, tabell 2) vises for en kandidat genet av interesse under tre forhold: kontroll, behandling 1, behandling 2. Grafen viser redusert uttrykk for kandidaten genet under behandlinger 1 og 2 i forhold til kontrollen (tabell 2). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Primer navn Retning Sekvens (5 - 3')
Ago24_F fremover TTTTCCCGGCACACCGAGT
Ago24_R omvendt GCCAAACTTTACACCCCGC
Siden 53_F fremover TGACGAACGTGGTTAGTCGT
Siden 53_R omvendt GGCATAACGTCCTAGTCACA
Siden 59_F fremover GCGAGTGGTATTCGCTTAGT
Siden 59_R omvendt GTTACCCTCGACGATTGCGT
Siden 66_F fremover TCGGTTTGGCAACGTCGGGC
Siden 66_R omvendt GACTAGGGAGATGCCGGCGA
Siden 69_F fremover CGACTCAGCCCCGAGATTT
Siden 69_R omvendt ATACAAGCAAACATAGACGGAA
Siden 84_F fremover GACAGTGGTGAGGTTTCAA
Siden 84_R omvendt ACTGGCGTTACCTTGTCTA
Siden 89_F fremover GAACAGTGCTCGCAGTCTAT
Siden 89_R omvendt GACAGCGTAAACATCGCGGT
Siden 126_F fremover GGTACATTCGTGTCGATTT
Siden 126_R omvendt TAAACGAAAAAACCACGTAC

Tabell 1: mikrosatellittmarkør primer sekvenser til genotype APHIS nerii 20 .

Mål Eksempel CT betyr CT Std. Dev ΔCt gjennomsnittlig ΔCt ΔΔCt RQ=2^(-ΔΔCt) RQ SEM
ef1a 1.1 22.59 0
ef1a 1.2 20.31 0
ef1a 1.3 20.36 0.226
ef1a 1.4 20,27 0.036
ef1a 1.5 20.55 0.003
ef1a 1.6 20.52 0.245
ef1a 2.1 20.49 0.082
ef1a 2.2 19,86 0.033
ef1a 2.3 20.19 0.037
ef1a 2.4 19.67 0.058
ef1a 2.5 20.25 0.188
ef1a 2.6 18.16 0.089
ef1a 3.1 20.93 0.157
ef1a 3.2 20,22 0.003
ef1a 3.3 20.44 0.039
ef1a 3.4 20.91 0.559
ef1a 3.5 20.63 0.017
ef1a 3.6 20,3 0.135
genet av interesse 1.1 24.6 0.173 2.01 0 1
genet av interesse 1.2 24.25 0.019 3.94 2.975 0 1 0
genet av interesse 1.3 24.79 0,04 4.43 0 1
genet av interesse 1.4 25.23 0.285 4.96 4.695 0 1 0
genet av interesse 1.5 24.6 0.103 4.05 0 1
genet av interesse 1.6 25.08 0.033 4.56 4.305 0 1 0
genet av interesse 2.1 27.52 0.155 7,03 5.019033762 0.03084042
genet av interesse 2.2 27.23 0.061 7.37 7.2 3.428355679 0.092888533 0.031024057
genet av interesse 2.3 27.18 0.058 6.99 2.56158174 0.169389724
genet av interesse 2.4 27.45 0 7.78 7.385 2.820764967 0.141535419 0.013927153
genet av interesse 2.5 27.44 0.032 7.19 3.138956897 0.113521944
genet av interesse 2.6 28 0 9.84 8.515 5.284272079 0.025661119 0.043930413
genet av interesse 3.1 27.23 0.143 6.3 4.292437371 0.051032588
genet av interesse 3.2 27.05 0.088 6.83 6.565 2.891234282 0.134788164 0.041877788
genet av interesse 3.3 27.45 0.109 7.01 2.578145722 0.167456035
genet av interesse 3.4 27.58 0.019 6,67 6.84 1.709038085 0.305863936 0.069203951
genet av interesse 3.5 27.06 0.067 6.43 2.384498984 0.191511246
genet av interesse 3.6 27.36 0 7.06 6.745 2.513723938 0.175103043 0.008204101

Tabell 2: beregninger for qPCR ΔΔC t verifikasjon av kandidaten genet. Kandidaten genuttrykk beregnes i forhold til ef1a (figur 6). Prøver 1.1-1.6 representerer seks biologiske replikerer under kontroll behandling prøver 2.1-2.6 representerer seks biologiske replikerer under behandling 1; eksempler 3.1-3.6 representerer seks biologiske replikerer under behandling 2. Ct Std. Dev. beregnes fra tre tekniske gjentak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det har lenge vært anerkjent som aposematic A. nerii kan gi innsikt i mønstre og mekanismer for resistens mot anlegget forsvar og spesielt kjemiske lagring18,37. En rekke genomisk ressurser har nylig kommet i A. nerii10, gir nye muligheter for økologiske og funksjonelle genomisk studier som bruker A. nerii som modell. Vi skissere grunnleggende protokoller i bladlus og plant kultur og molekylære/genomisk teknikker, med forutsetningen at fremtidig arbeid for denne arten sannsynligvis vil innebære studier som utnytter genomisk og funksjonelle økologiske metoder. Mange åpne spørsmål fortsatt om mekanismer og betydningen av cardenolide avgiftning og lagring i A. nerii. Teknikker som RNAi for uttrykket knockdown eller genet redigering metoder vil vise seg verdifull i denne forbindelse.

En av utfordringene i dyrking bladlus er i sin enestående kapasitet for reproduksjon og spredning. Disse trekkene, som direkte gjelder hvorfor de er alvorlig beskjære skadedyr, betyr at bladlus kulturer krever nesten daglig oppmerksomheten, som vel som forsiktig hvis isogenic linjer for eksperimenter. Teknikkene som er beskrevet ovenfor, inkludert de for generering av data for analyse av genuttrykk, ligner generelle protokoller for bladlus oppdrett og molekylære analyse, gir en bestemt trinnvis veiledning til å generere tilstrekkelig biologisk materiale for A. nerii for et mangfoldig sett av molekylære og økologiske programmer.

Dette hvis funksjonelle eller økologiske genomisk studier er på horisonten for A. nerii, må disse kombineres med bo kulturen å utnytte de eksperimentelle mulighetene de tilbyr. Insekt planteetere bor i komplekse samfunn på verten plantene, og både intraspecific vekselsvirkningene38,39 samt interspesifikk vekselsvirkningene40 forme ultimate svaret av A. nerii deres Salix . Salix, A. nerii spesialiserer seg på, representerer ulike sett med planter som uttrykker divergerende livshistorie strategier15,21, understreker viktigheten av rent genomisk eller fysiologiske tilnærminger med eksperimentell manipulasjoner som står for naturlig forekommende variasjon i A. nerii samfunn. Metodene som er nevnt her er utgangspunkt for en funksjonell og økologiske genomisk perspektiv på A. nerii og dets interaksjon med giftig Salix.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Michelle Moon (Vanderbilt University) for hjelp med fotografering. Vanderbilt University gitt støtte til PA og SSLB støttes av DGE-1445197.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sun Gro Fafard Germination Mix Hummert International 10-0952-2
Sun Gro Fafard 3B/ Metro Mix Hummert International 10-0951-2
2" x 4" Round Standard Pot Anderson Pots 1503
DreamTaq DNA Polymerase ThermoFisher Scientific EP0701
Trizol ThermoFisher Scientific 15596026
SuperScript® III First-Strand Synthesis kit ThermoFisher Scientific 18080051
Power SYBR Green PCR Master Mix ThermoFisher Scientific 4367659

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brisson, J. A., Stern, D. L. The pea aphid, Acyrthosiphon pisum.: an emerging genomic model system for ecological, developmental and evolutionary studies. BioEssays. 28, 747-755 (2006).
  2. Dixon, A. F. G. Aphid Ecology: An Optimization Approach. , Springer. Netherlands. (1985).
  3. Consortium, T. I. A. G. Genome Sequence of the Pea Aphid Acyrthosiphon pisum. PLoS Biology. , 1000313 (2010).
  4. Srinivasan, D. G., Brisson, J. A. Aphids: A Model for Polyphenism and Epigenetics. Genetics Research International. 2012, 1-12 (2012).
  5. Wenger, J. A., et al. Whole genome sequence of the soybean aphid, Aphis glycines. Insect Biochememistry and Molecular Biology. , 1-10 (2017).
  6. Aphidbase. Genouest.org. , Available from: bipaa.genouest.org/is/aphidbase/ (2018).
  7. Li, Z. -Q., et al. Ecological adaption analysis of the cotton aphid (Aphis gossypii) in different phenotypes by transcriptome comparison. PLoS ONE. 8, 83180 (2013).
  8. Wang, D., Liu, Q., Jones, H. D., Bruce, T., Xia, L. Comparative transcriptomic analyses revealed divergences of two agriculturally important aphid species. BMC Genomics. 15 (1), 1023-1024 (2014).
  9. Wu, S., et al. De novo characterization of the pine aphid Cinara pinitabulaeformis Zhang et Zhang transcriptome and analysis of genes relevant to pesticides. PLoS ONE. 12, 0178496-0178517 (2017).
  10. Birnbaum, S. S. L., Rinker, D. C., Gerardo, N. M., Abbot, P. Transcriptional profile and differential fitness in a specialist milkweed insect across host plants varying in toxicity. Molecular Ecology. , (2017).
  11. Dixon, A. F. G. Insect Herbivore-Host Dynamics. , Cambridge University Press. Cambridge. (2005).
  12. Goggin, F. L. Plant-aphid interactions: molecular and ecological perspectives. Current Opinion in Plant Biology. 10, 399-408 (2007).
  13. Will, T., Furch, A., Zimmermann, M. R. How phloem-feeding insects face the challenge of phloem-located defenses. Frontiers in Plant Science. 4, 1-12 (2013).
  14. Webster, B. The role of olfaction in aphid host location. Physiological Entomology. 37, 10-18 (2012).
  15. Agrawal, A. A., Petschenka, G., Bingham, R. A., Weber, M. G., Rasmann, S. Toxic cardenolides: chemical ecology and coevolution of specialized plant-herbivore interactions. New Phytologist. 194, 28-45 (2012).
  16. Dobler, S., Petschenka, G., Pankoke, H. Coping with toxic plant compounds- the insect's perspective on iridoid glycosides and cardenolides. Phytochemistry. 72, 1593-1604 (2011).
  17. Opitz, S. E. W., Müller, C. Plant chemistry and insect sequestration. Chemoecology. 19, 117-154 (2009).
  18. Birnbaum, S. S. L., Abbot, P. Insect adaptations toward plant toxins in milkweed-herbivores systems - a review. Entomologia Experimentalis et Applicata. 58, 579-610 (2018).
  19. Rothschild, M., von Euw, J., Reichstein, T. Cardiac glycosides in the oleander aphid, Aphis nerii. Journal of Insect Physiology. 16, 1141-1145 (1970).
  20. Harrison, J. S., Mondor, E. B. Evidence for an invasive aphid 'superclone': extremely low genetic diversity in oleander aphid (Aphis nerii) populations in the southern United States. PLoS ONE. 6, 17524 (2011).
  21. Mooney, K. A., Halitschke, R., Kessler, A., Agrawal, A. A. Evolutionary trade-offs in plants mediate the strength of trophic cascades. Science. 327, 1642-1644 (2010).
  22. Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. Bioinformatics. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (2010).
  23. Grabherr, M. G., et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nature Biotechnology. 29, 644-652 (2011).
  24. Haas, B. J., et al. De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis. Nature Protocols. 8, 1494-1512 (2013).
  25. Transdecoder. , Available from: http://transdecoder.sf.net (2018).
  26. Finn, R. D., et al. The Pfam protein families database: towards a more sustainable future. Nucleic Acids Research. 44, Database Issue 279-285 (2016).
  27. The UniProt Consortium. UniProt: the universal protein knowledgebase. Nucleic Acids Research. 45, 158-169 (2017).
  28. Johnson, M., et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 1 (36), 5-9 (2008).
  29. Hmmer.org. , Available from: http://hmmer.org (2018).
  30. Fu, L., Niu, B., Zhu, Z., Wu, S., Li, W. CD-HIT: accelerated for clustering the next generation sequencing data. Bioinformatics. 28 (23), 3150-3152 (2012).
  31. Simão, F. A., Waterhouse, R. M., Ioannidis, P., Kriventseva, E. V., Zdobnov, E. M. BUSCO: assessing genome assembly and annotation completeness with single-copy orthologs. Bioinformatics. 31, 3210-3212 (2015).
  32. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).
  33. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9, 357-359 (2012).
  34. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
  35. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15, 31 (2014).
  36. Rieu, I., Powers, S. J. Real-time quantitative RT-PCR: design, calculations, and statistics. Plant Cell. 21, 1031-1033 (2009).
  37. Malcolm, S. B. Chemical defence in chewing and sucking insect herbivores: plant-derived cardenolides in the monarch butterfly and oleander aphid. Chemoecology. 1, 12-21 (1990).
  38. Agrawal, A. A., Underwood, N., Stinchcombe, J. R. Intraspecific variation in the strength of density dependence in aphid populations. Ecological Entomology. 29, 521-526 (2004).
  39. Zehnder, C. B., Hunter, M. D. A comparison of maternal effects and current environment on vital rates of Aphis nerii, the milkweed-oleander aphid. Ecological Entomology. 32, 172-180 (2007).
  40. Hartbauer, M. Collective defense of Aphis nerii and Uroleucon hypochoeridis (Homoptera, Aphididae) against natural enemies. PLoS ONE. 5, 10417 (2010).

Tags

Genetikk problemet 138 bladlus drivhus milkweed mikrosatellittmarkør RNAseq qPCR plante-insekt interaksjon
Opprettholde biologisk kulturer og måle byggkorn under <em>Aphis nerii</em>: en ikke-modellsystem for plante-insekt interaksjoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Birnbaum, S. S. L., Rinker, D. C.,… More

Birnbaum, S. S. L., Rinker, D. C., Abbot, P. Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions. J. Vis. Exp. (138), e58044, doi:10.3791/58044 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter