Здесь мы опишем процедуру для очистки ткани, люминесцентные маркировки и крупномасштабных изображений мыши мозговой ткани, которая, таким образом, позволяет визуализации трехмерных организации типов клеток коры головного мозга.
Неокортекс млекопитающих состоит из многих типов возбуждающих и ингибирующих нейронов, каждый с конкретными электрофизиологических и биохимических свойств, синаптических связей, и в естественных условиях функции, но их основные функциональные и анатомические плохо понимается Организация от сотовой сети шкалой. Здесь мы описываем метод для трехмерных изображений дневно меченых нейронов через большие участки мозга для расследования кортикального слоя клеточной организации. Конкретные типы нейронов помечены введения флуоресцентных Ретроградная нейрональных Трейсеры или выражением флуоресцентных белков у трансгенных мышей. Блока мозга образцы, например, полушария, готовятся после фиксации, прозрачными с ткани, очистка методов и подвергается флуоресцентный immunolabeling типов конкретных клеток. Большие площади, проверяются с помощью конфокальной или два Фотон Микроскопы, с большого расстояния рабочих целей и моторизованных этапов. Этот метод может решить периодической организации конкретного типа microcolumn функциональных модулей ячейки в коры головного мозга мыши. Процедура может быть полезным для изучения трехмерной сотовой архитектуры в областях различных мозга и других сложных тканей.
Неокортекс млекопитающих состоит из большого числа типов клеток, каждый с картин выражения определенного гена, электрофизиологических и биохимических свойств, синаптических связей, и в естественных условиях функции1,2 ,3,4,5,6,7. Ли эти типы клеток организованы неоднократные структуры был неясным. Корковых столбцы, включая столбцы визуальные ориентации и соматосенсорные бочки, повторили структур, но их клеточной Организации остается неясным8,9. Они присутствуют в конкретных областях, коры и не мозг всей системы.
В слое 5 кортикальное значительное большинство нейронов, подразделяются на четыре основных типа. Основной тип возбуждающих нейронов, югу мозгового проекции нейронов, проекты аксоны подкорковых целей, включая Понс, спинного мозга и четверохолмия и, таким образом, представляет основные корковые выходной путь10. Проекции корковых нейронов, другой основной тип возбуждающих нейронов, иннервируют коры10. Ингибирующих нейронов также содержит два основных класса: выражая Парвальбумин и соматостатина выражая клетки11.
Недавние анализы показывают, что типы четыре ячейки организованы в неоднократных структуры12,,1314. Югу мозгового проекции нейронов12,13,14 и корковые проекции нейронов14 организовать в конкретных microcolumns тип ячейки диаметром 1 – 2 клетки. Парвальбумин выражая и соматостатина выражая клетки выровнять специально с microcolumns югу мозгового проекции нейронов, но не с microcolumns проекции корковых нейронов14. Microcolumns, сами периодически выровнять форма шестиугольная решетка массива14 и присутствуют в нескольких корковых областях, включая визуальные и соматосенсорные мотор районы мыши мозга12,14 и на языке области человеческого мозга13. Нейронов в отдельных microcolumn выставку синхронизированной активности и имеют аналогичные сенсорные ответы14. Эти наблюдения показывают, что слой 5 типов клеток организовать в структуру решетки microcolumn, представляющий первый известный мозг всей Организации повторения функциональных модулей.
Microcolumns имеют радиус около 10 мкм и пространственной периодичности приблизительно 40 мкм. Кроме того параллельно с их апикальных дендритов и изменения в зависимости от их позиции в коре14ориентации microcolumns. Таким образом система microcolumn трудно анализировать с помощью обычных корковых ломтики с типичной толщиной в несколько десятков микрометров. Кроме того анализ периодичности требует трехмерных данных от широкий спектр областей мозга и, следовательно, типичный визуализации области конфокальной микроскопии или в естественных условиях 2-фотонных изображений является слишком узким.
Недавно были разработаны методы для очистки толстые ткани15,16. Здесь мы описываем применение этих методов для получения типов основных клеток мыши кортикальное слоя 5 крупномасштабных, трехмерные изображения, которые составляют систему microcolumn. Subcerebral проекции нейронов помечены путем ретроградного маркировки или выражение расширенной Зеленый флуоресцирующий белок в Панамакс egfp трансгенных мышей12и корковые проекции, которые нейронами помечены путем ретроградного маркировки или выражением tdTomato в Tlx3–cre/Ai9 мышей17. Парвальбумин выражая и соматостатина выражая клетки помечены, иммуногистохимия. Метод (антитела шкалы S) AbScale18 используется для антитело пятная экспериментов, в то время как для других экспериментов используется метод SeeDB (см. глубокие мозга)19 . Эти методы преодоления вышеуказанных трудностей обычных методов обработки изображений и выявить точные клеточной организации слой 514.
Мы представили процедуры для получения крупных трехмерные изображения клетки конкретного типа организации типов основных клеток мыши кортикальное слоя 5. По сравнению с обычных ломтик окрашивание, метод является более полезным в определении трехмерной Организации коры головного моз…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Atsushi Miyawaki и Хироси Хама за их советы по AbScale эксперименты, Чарльз Yokoyama для редактирования рукописи, Эрико Ohshima и Миюки Кишино для их технической помощи. Эта работа была поддержана исследовательских фондов от RIKEN т.г. и дотаций для научных исследований от министерства образования, культуры, спорта, науки и техники (МПКСНТ) Японии т.г. (инновационных областей «Мезоскопических Neurocircuitry»; 22115004) и С.С. (25890023).
Crym-egfp transgenic mice | MMRRC | 012003-UCD | |
Tlx3-cre transgenic mice | MMRRC | 36547-UCD | |
ROSA-CAG-flox-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX #7909 | |
Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-01 | 0.5 mm thickness |
Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-02 | 1.0 mm thickness |
Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-05 | 3.0 mm thickness |
Petri dishes | Falcon | 351008 | |
Cover glass | Matsunami | C022241 | |
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | C22841 | |
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | C22843 | |
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | C22842 | |
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate | Invitrogen | C34778 | |
26G Hamilton syringe | Hamilton | 701N | |
Injector pump | KD Scientific | KDS 310 | Pons injection |
Injector pump | KD Scientific | KDS 100 | Superior colliculus injection |
Manipulator | Narishige | SM-15 | |
Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl | |
Isoflurane | Pfizer | ||
Lidocaine | AstraZeneca | Xylocaine injection 1% with epinephrine | |
Drill | Toyo Associates | HP-200 | |
Avitene microfibrillar hemostat | Davol Inc | 1010090 | |
Alonalfa | Daiichi-Sankyo | Alonalpha A | |
Surgical silk | Ethicon | K881H | |
Incubator | UVP | HB-1000 Hybridizer | |
Glass pipette | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
Electrode puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
Paraffin Liquid, light | Nacalai tesque | 26132-35 | |
Saline | Otsuka | 1326 | |
Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 26126-54 | |
Tungsten needle | Inter medical | Φ0.1 *L200 mm | |
Vibratome | Leica | VT1000S | |
50 mL plastic tube | Falcon | 352070 | |
α-thioglycerol | Nacalai tesque | 33709-62 | |
D(-) Fructose | Nacalai tesque | 16315-55 | |
BluTack | Bostik | CKBT-450000 | |
Two-photon microscope | Nikon | A1RMP | |
Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm | |
Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm | |
Motorized stage | COMS | PT100C-50XY | |
Filter | Semrock | FF01-492/SP-25 | |
Filter | Semrock | FF03-525/50-25 | |
Filter | Semrock | FF03-575/25-25 | |
Filter | Semrock | FF01-629/56 | |
Filter | Chroma | D605/55m | |
5 mL plastic tube | AS ONE | VIO-5B | |
2 mL plastic tube | Eppendorf | 0030120094 | |
Urea | Nacalai tesque | 35905-35 | |
Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
Glyserol | Sigma-aldrich | 191612 | |
D(-)-sorbitol | Wako | 191-14735 | |
Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo chemical industry | M1356 | |
γ-Cyclodextrin | Wako | 037-10643 | |
N-acetyl-L-hydroxyproline | Skin Essential Actives | 33996-33-7 | |
DMSO | Nacalai tesque | 13445-45 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A7906 | |
Tween-20 (1.1 g/mL) | Nacalai tesque | 35624-15 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21428 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21235 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | |
Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
Water-immersion long working distance objectives | Olympus | XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm | |
Anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
Anti-NeuN | Millipore | ABN78 | |
Anti-CTIP2 | Abcam | ab18465 | |
Anti-Statb2 | Abcam | ab51502 | |
Anti-GAD67 | Millipore | MAB5406 | |
Anti-GABA | Sigma | A2052 | |
Anti-Parvalbumin | Swant | 235 | |
Anti-Parvalbumin | Frontier Institute | PV-Go-Af460 | |
Anti-Parvalbumin | Sigma | P3088 | |
Anti-Parvalbumin | Abcam | ab11427 | |
Anti-Somatostatin | Peninsula Laboratories | T-4103 | |
Anti-c-Fos | CalbioChem | PC38 |