ここで組織をクリア、蛍光標識と、それによって、大脳新皮質の細胞型の三次元組織の可視化を可能にするマウスの脳組織の大規模なイメージング手順をについて説明します。
哺乳類の大脳皮質は特定の電気生理学的および生化学的性質、シナプス、それぞれ興奮性と抑制性のニューロンの多くの種類の構成され、生体内での機能しますが、彼らの基本的な機能と解剖学的組織細胞からネットワークの規模にはよくわかっていません。ここで脳皮質の細胞組織の調査のための広い領域にわたって蛍光標識細胞の三次元イメージング法について述べる.特定の種類のニューロンの蛍光の逆行性神経トレーサーの注射やトランスジェニック マウスにおける蛍光タンパク質の発現によってラベルです。ブロック脳サンプルなど北半球の固定後に準備、透明なクリア方法、組織で作られて、特定の細胞型の蛍光反応を受けます。大きな作動距離の対物レンズとモーターを備えられた段階装備共焦点または 2 光子の顕微鏡を使用して大規模な領域がスキャンされます。このメソッドは、マウス大脳皮質における細胞型固有マイクロカラム機能モジュールの定期的な組織を解決できます。プロシージャは、多様な脳の領域や他の複雑な組織に三次元細胞アーキテクチャの研究のために役立ちます。
哺乳類の大脳皮質はそれぞれ特定の遺伝子発現パターン、電気生理学的および生化学的特性、シナプス接続は、細胞の種類、数が多いから成るし、生体内機能1,2 、3,4,5,6,7。これらの細胞型を繰り返し構造に整理するかどうかがはっきりしなかった。視覚的方位選択性コラムや体性感覚の樽など、皮質カラム構造を繰り返しているが、細胞組織不明8,9のままです。これらは特定の皮質領域内に存在であり、脳全体のシステムではないです。
新皮質層 5 のニューロンの大部分は、4 つの主要な種類に分類されます。サブ大脳投射ニューロン興奮性ニューロンの主要なタイプは、ポンス、脊髄、上丘など皮質下のターゲットへ軸索をプロジェクトし、したがって、皮質の主要な出力経路10を表します。皮質投射ニューロンの興奮性ニューロンのもう一つの主要なタイプは、皮質10を支配します。抑制的なニューロンはまた 2 つの主要なクラスを含む: パルブアルブミンと表現する-ソマトスタチン細胞11。
最近の分析は示す繰り返し構造12,13,14に 4 つのセルの種類を分類しました。サブ大脳投射ニューロン12,13,14と皮質投射ニューロン14は、直径 1-2 細胞の配向柱状を特定細胞型に整理します。パルブアルブミンとソマトスタチンを表現する細胞は、サブ大脳投射ニューロンの配向柱状で具体的にはなく、皮質投射ニューロン14の配向柱状を合わせます。配向柱状自身は定期的にフォーム六角形格子配列14およびマウス脳12,14言語、視覚、体性感覚と運動の分野を含む複数の皮質にある整列します。人間の脳の13のエリア。マイクロカラムを個々 のニューロン同期された活動の展示し、同様の感覚の反応がある14。これらの観察は、レイヤー 5 セル タイプはまとめる機能モジュールを繰り返しの最初の知られている脳全体の組織を表すマイクロカラム格子構造を示しています。
配向柱状約 10 μ m の半径を持っていると約 40 μ m の空間的周期.また、配向柱状の向きは尖樹状突起、皮質14の彼らの位置によって変化に平行です。したがって、マイクロカラム システムは数十マイクロメートルの典型的な厚さと従来の皮質のスライスを使用して解析することは困難です。さらに、周期性の解析の脳領域と、したがって、共焦点顕微鏡の典型的な画像領域の広い範囲から三次元データを必要とするまたは 2 光子励起イメージング生体内では狭すぎます。
最近では、厚い組織15,16をクリアする技術が開発されています。ここマイクロカラム システムを構成するマウス皮質層 5 の主要な細胞型の大型の三次元のイメージを取得するこれらのメソッドのアプリケーションについて述べる。逆行性ラベリングすることCrym egfpトランスジェニック マウス12と皮質投射ニューロンは、逆行のどちらかによりラベル付けされた強化された緑色蛍光タンパク質の発現によって、皮質下投射ニューロンが付きますラベリングやTlx3–cre/Ai9 マウス17の tdTomato 式で。パルブアルブミンと表現する-ソマトスタチン細胞の免疫組織化学によるラベルです。(抗体スケール S) AbScale 法18 (を参照してください深い脳) SeeDB 法19他の実験に使用されている間、実験を汚す抗体が使用されます。これらのメソッドは、従来のイメージング方法上記の困難を克服し、層 514の正確な細胞組織を明らかにします。
我々 はマウス皮質層 5 の主要な細胞型の細胞型特異組織の大規模な三次元画像を取得するための手順を提示しています。従来スライス染色に比べると、メソッドは新皮質の三次元組織の決定に有用です。メソッドにより、広いから画像取り込みと深い脳領域は一般的な生体内の2 光子励起顕微鏡または従来の共焦点顕微鏡と比較してし、したがって、皮質細胞の包括的な分析を許可で?…
The authors have nothing to disclose.
ありがとう宮脇敦史・洋浜 AbScale 実験に彼らのアドバイスは、原稿の編集のためのチャールズ ・横山恵理子大島とその技術支援のみゆき岸野。この仕事は科学研究省の教育、文化、スポーツ、科学、技術 (文部科学省) 日本の倫理学に理化学研究所から研究資金倫理学と補助金によって支えられた (革新的なエリア「メゾスコ ピック Neurocircuitry」; 22115004) とS. S. (25890023)。
Crym-egfp transgenic mice | MMRRC | 012003-UCD | |
Tlx3-cre transgenic mice | MMRRC | 36547-UCD | |
ROSA-CAG-flox-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX #7909 | |
Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-01 | 0.5 mm thickness |
Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-02 | 1.0 mm thickness |
Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-05 | 3.0 mm thickness |
Petri dishes | Falcon | 351008 | |
Cover glass | Matsunami | C022241 | |
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | C22841 | |
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | C22843 | |
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | C22842 | |
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate | Invitrogen | C34778 | |
26G Hamilton syringe | Hamilton | 701N | |
Injector pump | KD Scientific | KDS 310 | Pons injection |
Injector pump | KD Scientific | KDS 100 | Superior colliculus injection |
Manipulator | Narishige | SM-15 | |
Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl | |
Isoflurane | Pfizer | ||
Lidocaine | AstraZeneca | Xylocaine injection 1% with epinephrine | |
Drill | Toyo Associates | HP-200 | |
Avitene microfibrillar hemostat | Davol Inc | 1010090 | |
Alonalfa | Daiichi-Sankyo | Alonalpha A | |
Surgical silk | Ethicon | K881H | |
Incubator | UVP | HB-1000 Hybridizer | |
Glass pipette | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
Electrode puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
Paraffin Liquid, light | Nacalai tesque | 26132-35 | |
Saline | Otsuka | 1326 | |
Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 26126-54 | |
Tungsten needle | Inter medical | Φ0.1 *L200 mm | |
Vibratome | Leica | VT1000S | |
50 mL plastic tube | Falcon | 352070 | |
α-thioglycerol | Nacalai tesque | 33709-62 | |
D(-) Fructose | Nacalai tesque | 16315-55 | |
BluTack | Bostik | CKBT-450000 | |
Two-photon microscope | Nikon | A1RMP | |
Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm | |
Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm | |
Motorized stage | COMS | PT100C-50XY | |
Filter | Semrock | FF01-492/SP-25 | |
Filter | Semrock | FF03-525/50-25 | |
Filter | Semrock | FF03-575/25-25 | |
Filter | Semrock | FF01-629/56 | |
Filter | Chroma | D605/55m | |
5 mL plastic tube | AS ONE | VIO-5B | |
2 mL plastic tube | Eppendorf | 0030120094 | |
Urea | Nacalai tesque | 35905-35 | |
Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
Glyserol | Sigma-aldrich | 191612 | |
D(-)-sorbitol | Wako | 191-14735 | |
Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo chemical industry | M1356 | |
γ-Cyclodextrin | Wako | 037-10643 | |
N-acetyl-L-hydroxyproline | Skin Essential Actives | 33996-33-7 | |
DMSO | Nacalai tesque | 13445-45 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A7906 | |
Tween-20 (1.1 g/mL) | Nacalai tesque | 35624-15 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21428 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21235 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | |
Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
Water-immersion long working distance objectives | Olympus | XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm | |
Anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
Anti-NeuN | Millipore | ABN78 | |
Anti-CTIP2 | Abcam | ab18465 | |
Anti-Statb2 | Abcam | ab51502 | |
Anti-GAD67 | Millipore | MAB5406 | |
Anti-GABA | Sigma | A2052 | |
Anti-Parvalbumin | Swant | 235 | |
Anti-Parvalbumin | Frontier Institute | PV-Go-Af460 | |
Anti-Parvalbumin | Sigma | P3088 | |
Anti-Parvalbumin | Abcam | ab11427 | |
Anti-Somatostatin | Peninsula Laboratories | T-4103 | |
Anti-c-Fos | CalbioChem | PC38 |