Summary

マウス大脳皮質における細胞組織の大規模三次元イメージング

Published: September 05, 2018
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Summary

ここで組織をクリア、蛍光標識と、それによって、大脳新皮質の細胞型の三次元組織の可視化を可能にするマウスの脳組織の大規模なイメージング手順をについて説明します。

Abstract

哺乳類の大脳皮質は特定の電気生理学的および生化学的性質、シナプス、それぞれ興奮性と抑制性のニューロンの多くの種類の構成され、生体内での機能しますが、彼らの基本的な機能と解剖学的組織細胞からネットワークの規模にはよくわかっていません。ここで脳皮質の細胞組織の調査のための広い領域にわたって蛍光標識細胞の三次元イメージング法について述べる.特定の種類のニューロンの蛍光の逆行性神経トレーサーの注射やトランスジェニック マウスにおける蛍光タンパク質の発現によってラベルです。ブロック脳サンプルなど北半球の固定後に準備、透明なクリア方法、組織で作られて、特定の細胞型の蛍光反応を受けます。大きな作動距離の対物レンズとモーターを備えられた段階装備共焦点または 2 光子の顕微鏡を使用して大規模な領域がスキャンされます。このメソッドは、マウス大脳皮質における細胞型固有マイクロカラム機能モジュールの定期的な組織を解決できます。プロシージャは、多様な脳の領域や他の複雑な組織に三次元細胞アーキテクチャの研究のために役立ちます。

Introduction

哺乳類の大脳皮質はそれぞれ特定の遺伝子発現パターン、電気生理学的および生化学的特性、シナプス接続は、細胞の種類、数が多いから成るし、生体内機能1,2 3,4,5,6,7。これらの細胞型を繰り返し構造に整理するかどうかがはっきりしなかった。視覚的方位選択性コラムや体性感覚の樽など、皮質カラム構造を繰り返しているが、細胞組織不明8,9のままです。これらは特定の皮質領域内に存在であり、脳全体のシステムではないです。

新皮質層 5 のニューロンの大部分は、4 つの主要な種類に分類されます。サブ大脳投射ニューロン興奮性ニューロンの主要なタイプは、ポンス、脊髄、上丘など皮質下のターゲットへ軸索をプロジェクトし、したがって、皮質の主要な出力経路10を表します。皮質投射ニューロンの興奮性ニューロンのもう一つの主要なタイプは、皮質10を支配します。抑制的なニューロンはまた 2 つの主要なクラスを含む: パルブアルブミンと表現する-ソマトスタチン細胞11

最近の分析は示す繰り返し構造12,13,14に 4 つのセルの種類を分類しました。サブ大脳投射ニューロン12,13,14と皮質投射ニューロン14は、直径 1-2 細胞の配向柱状を特定細胞型に整理します。パルブアルブミンとソマトスタチンを表現する細胞は、サブ大脳投射ニューロンの配向柱状で具体的にはなく、皮質投射ニューロン14の配向柱状を合わせます。配向柱状自身は定期的にフォーム六角形格子配列14およびマウス脳12,14言語、視覚、体性感覚と運動の分野を含む複数の皮質にある整列します。人間の脳の13のエリア。マイクロカラムを個々 のニューロン同期された活動の展示し、同様の感覚の反応がある14。これらの観察は、レイヤー 5 セル タイプはまとめる機能モジュールを繰り返しの最初の知られている脳全体の組織を表すマイクロカラム格子構造を示しています。

配向柱状約 10 μ m の半径を持っていると約 40 μ m の空間的周期.また、配向柱状の向きは尖樹状突起、皮質14の彼らの位置によって変化に平行です。したがって、マイクロカラム システムは数十マイクロメートルの典型的な厚さと従来の皮質のスライスを使用して解析することは困難です。さらに、周期性の解析の脳領域と、したがって、共焦点顕微鏡の典型的な画像領域の広い範囲から三次元データを必要とするまたは 2 光子励起イメージング生体内では狭すぎます。

最近では、厚い組織15,16をクリアする技術が開発されています。ここマイクロカラム システムを構成するマウス皮質層 5 の主要な細胞型の大型の三次元のイメージを取得するこれらのメソッドのアプリケーションについて述べる。逆行性ラベリングすることCrym egfpトランスジェニック マウス12と皮質投射ニューロンは、逆行のどちらかによりラベル付けされた強化された緑色蛍光タンパク質の発現によって、皮質下投射ニューロンが付きますラベリングやTlx3cre/Ai9 マウス17の tdTomato 式で。パルブアルブミンと表現する-ソマトスタチン細胞の免疫組織化学によるラベルです。(抗体スケール S) AbScale 法18 (を参照してください深い脳) SeeDB 法19他の実験に使用されている間、実験を汚す抗体が使用されます。これらのメソッドは、従来のイメージング方法上記の困難を克服し、層 514の正確な細胞組織を明らかにします。

Protocol

すべて実験プロシージャ理化学研究所和光動物実験委員会と理化学研究所遺伝子組換え実験安全委員会によって承認され、理化学研究所脳科学の動物施設の制度のガイドラインに従って実行研究所。 1. イメージング室の準備 イメージング室19 シリコーンゴム シートを使用して、様々 な厚さの約 5 mm ・床版の厚さの商工会議…

Representative Results

我々 は/Ai9 トランスジェニック マウスのTlx3-creで tdTomato の発現による皮質投射ニューロンをラベルし、サブ大脳投射ニューロンを橋に CTB488 の逆行性のトレーサーを注入して可視化します。脳の左半球は SeeDB メソッドを受けたし、長い作業距離目的浸水を搭載した 2 光子顕微鏡を使用してスキャン (25 X、n. a. 1.1 作動距離 2 mm) と電動ステージ。401 の画像…

Discussion

我々 はマウス皮質層 5 の主要な細胞型の細胞型特異組織の大規模な三次元画像を取得するための手順を提示しています。従来スライス染色に比べると、メソッドは新皮質の三次元組織の決定に有用です。メソッドにより、広いから画像取り込みと深い脳領域は一般的な生体内の2 光子励起顕微鏡または従来の共焦点顕微鏡と比較してし、したがって、皮質細胞の包括的な分析を許可で?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ありがとう宮脇敦史・洋浜 AbScale 実験に彼らのアドバイスは、原稿の編集のためのチャールズ ・横山恵理子大島とその技術支援のみゆき岸野。この仕事は科学研究省の教育、文化、スポーツ、科学、技術 (文部科学省) 日本の倫理学に理化学研究所から研究資金倫理学と補助金によって支えられた (革新的なエリア「メゾスコ ピック Neurocircuitry」; 22115004) とS. S. (25890023)。

Materials

Crym-egfp transgenic mice MMRRC 012003-UCD
Tlx3-cre transgenic mice MMRRC 36547-UCD
ROSA-CAG-flox-tdTomato mice Jackson Laboratory JAX #7909
Silicone rubber sheet AS ONE 6-611-01 0.5 mm thickness
Silicone rubber sheet AS ONE 6-611-02 1.0 mm thickness
Silicone rubber sheet AS ONE 6-611-05 3.0 mm thickness
Petri dishes Falcon 351008
Cover glass Matsunami C022241
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate Invitrogen C22841
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate Invitrogen C22843
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate Invitrogen C22842
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate Invitrogen C34778
26G Hamilton syringe Hamilton 701N
Injector pump KD Scientific KDS 310 Pons injection
Injector pump KD Scientific KDS 100 Superior colliculus injection
Manipulator Narishige SM-15
Sodium pentobarbital Kyoritsu Seiyaku Somnopentyl
Isoflurane Pfizer
Lidocaine AstraZeneca Xylocaine injection 1% with epinephrine
Drill Toyo Associates HP-200
Avitene microfibrillar hemostat Davol Inc 1010090
Alonalfa Daiichi-Sankyo Alonalpha A
Surgical silk Ethicon K881H
Incubator UVP HB-1000 Hybridizer
Glass pipette Drummond Scientific Company 2-000-075
Electrode puller Sutter Instrument Company P-97
Paraffin Liquid, light Nacalai tesque 26132-35
Saline Otsuka 1326
Paraformaldehyde Nacalai tesque 26126-54
Tungsten needle Inter medical Φ0.1 *L200 mm
Vibratome Leica VT1000S
50 mL plastic tube Falcon 352070
α-thioglycerol Nacalai tesque 33709-62
D(-) Fructose Nacalai tesque 16315-55
BluTack Bostik CKBT-450000
Two-photon microscope Nikon A1RMP
Water-immersion long working distance objectives Nikon CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm
Water-immersion long working distance objectives Nikon CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm
Motorized stage COMS PT100C-50XY
Filter Semrock FF01-492/SP-25
Filter Semrock FF03-525/50-25
Filter Semrock FF03-575/25-25
Filter Semrock FF01-629/56
Filter Chroma D605/55m
5 mL plastic tube AS ONE VIO-5B
2 mL plastic tube Eppendorf  0030120094
Urea Nacalai tesque 35905-35
Triton X-100 Nacalai tesque 35501-15
Glyserol Sigma-aldrich 191612
D(-)-sorbitol Wako 191-14735
Methyl-β-cyclodextrin Tokyo chemical industry M1356
γ-Cyclodextrin Wako 037-10643
N-acetyl-L-hydroxyproline Skin Essential Actives 33996-33-7
DMSO Nacalai tesque 13445-45
Bovine Serum Albumin Sigma-aldrich A7906
Tween-20 (1.1 g/mL) Nacalai tesque 35624-15
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen A21422
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen A21428
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A21235
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11029
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A21206
Confocal microscope Olympus FV1000
Water-immersion long working distance objectives Olympus XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm
Anti-NeuN Millipore MAB377
Anti-NeuN Millipore ABN78
Anti-CTIP2 Abcam ab18465
Anti-Statb2 Abcam ab51502
Anti-GAD67 Millipore MAB5406
Anti-GABA Sigma A2052
Anti-Parvalbumin Swant 235
Anti-Parvalbumin Frontier Institute PV-Go-Af460
Anti-Parvalbumin Sigma P3088
Anti-Parvalbumin Abcam ab11427
Anti-Somatostatin Peninsula Laboratories T-4103
Anti-c-Fos CalbioChem PC38

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Cite This Article
Yoneda, T., Sakai, S., Maruoka, H., Hosoya, T. Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex. J. Vis. Exp. (139), e58027, doi:10.3791/58027 (2018).

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