माउस Neocortex में सेलुलर संगठन के बड़े पैमाने पर तीन आयामी इमेजिंग
Summary
यहाँ हम ऊतक समाशोधन के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन, फ्लोरोसेंट लेबलिंग, और माउस मस्तिष्क ऊतक के बड़े पैमाने पर इमेजिंग, जिससे, neocortex में कोशिका प्रकार के तीन आयामी संगठन के दृश्य में सक्षम बनाता है.
Abstract
स्तनधारी neocortex उत्तेजक और निरोधात्मक न्यूरॉन्स के कई प्रकार से बना है, विशिष्ट electrophysiological और जैव रासायनिक गुणों के साथ प्रत्येक, synaptic कनेक्शन, और vivo कार्यों में , लेकिन उनके बुनियादी कार्यात्मक और संरचनात्मक नेटवर्क स्केल करने के लिए सेलुलर से संगठन खराब समझ है । यहाँ हम cortical सेलुलर संगठन की जांच के लिए मस्तिष्क के बड़े क्षेत्रों में फ्लोरोसेंट-लेबल वाले न्यूरॉन्स के तीन आयामी इमेजिंग के लिए एक विधि का वर्णन. न्यूरॉन्स के विशिष्ट प्रकार फ्लोरोसेंट प्रतिगामी न्यूरॉन्स या ट्रांसजेनिक चूहों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति के इंजेक्शन द्वारा लेबल कर रहे हैं. ब्लॉक मस्तिष्क के नमूनों, जैसे, एक गोलार्द्ध, निर्धारण के बाद तैयार कर रहे हैं, ऊतक समाशोधन तरीकों के साथ पारदर्शी बनाया, और विशिष्ट कोशिका प्रकार के फ्लोरोसेंट immunolabeling के अधीन । बड़े क्षेत्रों फोकल या दो फोटॉन सूक्ष्मदर्शी बड़े काम दूरी उद्देश्यों और मोटर चालित चरणों से सुसज्जित का उपयोग कर स्कैन कर रहे हैं । इस विधि में माउस neocortex कक्ष प्रकार-विशिष्ट microcolumn कार्यशील मॉड्यूल की आवर्ती संगठन को हल कर सकते हैं । प्रक्रिया विविध मस्तिष्क क्षेत्रों और अंय जटिल ऊतकों में तीन आयामी सेलुलर वास्तुकला के अध्ययन के लिए उपयोगी हो सकता है ।
Introduction
स्तनधारी neocortex कोशिका प्रकार की एक बड़ी संख्या से बना है, विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के साथ प्रत्येक, electrophysiological और जैव रासायनिक गुण, synaptic कनेक्शन, और vivo में कार्य करताहै 1,2 ,3,4,5,6,7. क्या इन सेल प्रकार दोहराया संरचनाओं में आयोजित कर रहे है अस्पष्ट है । Cortical कॉलम, दृश्य अभिविंयास कॉलम और somatosensory बैरल सहित, दोहराया संरचनाओं है, लेकिन उनके सेलुलर संगठन अस्पष्ट8,9रहता है । ये विशिष्ट cortical क्षेत्रों में विद्यमान हैं और मस्तिष्क-व्यापी व्यवस्था नहीं हैं.
neocortical परत 5 में, न्यूरॉन्स के बड़े बहुमत चार प्रमुख प्रकार में वर्गीकृत कर रहे हैं. उत्तेजक न्यूरॉन्स की एक प्रमुख प्रकार, उप मस्तिष्क प्रक्षेपण न्यूरॉन्स, pons, रीढ़ की हड्डी, और बेहतर colliculus सहित subcortical लक्ष्यों को axons परियोजनाओं, और, इसलिए, प्रमुख cortical उत्पादन मार्ग10का प्रतिनिधित्व करता है. Cortical प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स, उत्तेजक न्यूरॉन्स की एक अन्य प्रमुख प्रकार, अंदर आना प्रांतस्था10. निरोधात्मक न्यूरॉन्स में भी दो प्रमुख वर्ग होते हैं: parvalbumin-एक्सप्रेस और सोमेटोस्टैटिन-एक्सप्रेस कोशिकाओं11.
हाल के विश्लेषणों से संकेत मिलता है कि चार कक्ष प्रकार दोहराया संरचनाओं12,13,14में आयोजित कर रहे हैं । दोनों उप-मस्तिष्क प्रक्षेपण न्यूरॉन्स12,13,14 और cortical प्रक्षेपण न्यूरॉन्स14 कक्ष-प्रकार विशिष्ट microcolumns में 1 – 2 कक्षों का व्यास के साथ व्यवस्थित करें । Parvalbumin-एक्सप्रेस और सोमेटोस्टैटिन-एक्सप्रेस कोशिकाओं विशेष रूप से उप-मस्तिष्क प्रक्षेपण न्यूरॉन्स के microcolumns के साथ नहीं बल्कि cortical प्रक्षेपण न्यूरॉन्स14के microcolumns के साथ संरेखित करें. Microcolumns खुद को समय से एक षट्कोण जाली सरणी फार्म के लिए संरेखित करें और दृश्य, somatosensory, और माउस मस्तिष्क12,14 और भाषा में मोटर क्षेत्रों सहित कई cortical क्षेत्रों में मौजूद हैं मानव मस्तिष्क के क्षेत्रों13. ंयूरॉंस में व्यक्तिगत microcolumn प्रदर्शन सिंक्रनाइज़ गतिविधि और इसी तरह संवेदी प्रतिक्रियाएं14। इन टिप्पणियों का संकेत है कि परत 5 सेल प्रकार एक microcolumn जाली कार्यात्मक मॉड्यूल दोहरा के पहले ज्ञात मस्तिष्क व्यापक संगठन का प्रतिनिधित्व संरचना में संगठित ।
Microcolumns लगभग 10 µm के एक त्रिज्या है और लगभग ४० µm के एक स्थानिक समय-अवधि है । इसके अलावा, microcolumns के उंमुखीकरण उनके शिखर dendrites और परिवर्तन प्रांतस्था14में अपनी स्थिति के आधार पर समानांतर है । इसलिए, microcolumn प्रणाली micrometers के कुछ दसियों की एक ठेठ मोटाई के साथ पारंपरिक cortical स्लाइस का उपयोग कर विश्लेषण करने के लिए मुश्किल है । इसके अलावा, आवधिकता के विश्लेषण मस्तिष्क क्षेत्रों की एक विस्तृत रेंज से तीन आयामी डेटा की आवश्यकता है, और इसलिए, फोकल माइक्रोस्कोपी के ठेठ इमेजिंग क्षेत्र या vivo 2-फोटॉन इमेजिंग में भी संकीर्ण है ।
हाल ही में, तकनीक15,16के घने ऊतकों को स्पष्ट करने के लिए विकसित किया गया है । यहां हम इन तरीकों के आवेदन का वर्णन करने के लिए बड़े पैमाने पर, तीन माउस neocortical 5 परत में प्रमुख कोशिका प्रकार के आयामी चित्र है कि microcolumn प्रणाली शामिल प्राप्त करते हैं । उपमस्तिष्क प्रक्षेपण न्यूरॉन्स प्रतिगामी लेबलिंग द्वारा या Crym-egfp ट्रांसजेनिक चूहों12में बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति द्वारा लेबल कर रहे हैं, और cortical प्रक्षेपण न्यूरॉन्स या तो प्रतिगामी द्वारा लेबल हैं लेबलिंग या Tlx3–cre/Ai9 चूहों में tdTomato अभिव्यक्ति द्वारा17. Parvalbumin-एक्सप्रेस और सोमेटोस्टैटिन-एक्सप्रेस कोशिकाओं immunohistochemistry द्वारा लेबल कर रहे हैं । (एंटीबॉडी स्केल S) AbScale विधि18 का प्रयोग एंटीबॉडी दाग-धब्बों के लिए किया जाता है, जबकि (देखें डीप ब्रेन) SeeDB विधि19 का प्रयोग अन्य प्रयोगों के लिए किया जाता है । इन तरीकों पारंपरिक इमेजिंग तरीकों की उपर्युक्त कठिनाइयों को दूर करने और 514परत के सटीक सेलुलर संगठन का पता चलता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमने माउस neocortical लेयर 5 में प्रमुख कक्ष प्रकार के कक्ष प्रकार-विशिष्ट संगठन के बड़े पैमाने पर तीन-आयामी छवियां प्राप्त करने के लिए कार्यविधियां प्रस्तुत की हैं । पारंपरिक टुकड़ा धुंधला की तुलना में, विधि…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम AbScaएलई प्रयोगों पर उनकी सलाह के लिए अतसुशी Miyawaki और हिरोशी हामा का शुक्रिया अदा करते हैं, चार्ल्स Yokoyama पांडुलिपि के संपादन के लिए, Eriko Ohshima और मियुकी Kishino उनकी तकनीकी सहायता के लिए । इस काम के लिए आरआईकेईएन से T.H. और अनुदान में अनुसंधान कोष द्वारा समर्थित था शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी के मंत्रालय से वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए सहायता (जापान के MEXT) T.H. (अभिनव क्षेत्रों “Mesoscopic Neurocircuitry”; २२११५००४) और एस॰एस॰ (२५८९००२३) ।
Materials
| Crym-egfp transgenic mice | MMRRC | 012003-UCD | |
| Tlx3-cre transgenic mice | MMRRC | 36547-UCD | |
| ROSA-CAG-flox-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX #7909 | |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-01 | 0.5 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-02 | 1.0 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-05 | 3.0 mm thickness |
| Petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Cover glass | Matsunami | C022241 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | C22841 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | C22843 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | C22842 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate | Invitrogen | C34778 | |
| 26G Hamilton syringe | Hamilton | 701N | |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 310 | Pons injection |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 100 | Superior colliculus injection |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl | |
| Isoflurane | Pfizer | ||
| Lidocaine | AstraZeneca | Xylocaine injection 1% with epinephrine | |
| Drill | Toyo Associates | HP-200 | |
| Avitene microfibrillar hemostat | Davol Inc | 1010090 | |
| Alonalfa | Daiichi-Sankyo | Alonalpha A | |
| Surgical silk | Ethicon | K881H | |
| Incubator | UVP | HB-1000 Hybridizer | |
| Glass pipette | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
| Electrode puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Paraffin Liquid, light | Nacalai tesque | 26132-35 | |
| Saline | Otsuka | 1326 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 26126-54 | |
| Tungsten needle | Inter medical | Φ0.1 *L200 mm | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 50 mL plastic tube | Falcon | 352070 | |
| α-thioglycerol | Nacalai tesque | 33709-62 | |
| D(-) Fructose | Nacalai tesque | 16315-55 | |
| BluTack | Bostik | CKBT-450000 | |
| Two-photon microscope | Nikon | A1RMP | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm | |
| Motorized stage | COMS | PT100C-50XY | |
| Filter | Semrock | FF01-492/SP-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-525/50-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-575/25-25 | |
| Filter | Semrock | FF01-629/56 | |
| Filter | Chroma | D605/55m | |
| 5 mL plastic tube | AS ONE | VIO-5B | |
| 2 mL plastic tube | Eppendorf | 0030120094 | |
| Urea | Nacalai tesque | 35905-35 | |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Glyserol | Sigma-aldrich | 191612 | |
| D(-)-sorbitol | Wako | 191-14735 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo chemical industry | M1356 | |
| γ-Cyclodextrin | Wako | 037-10643 | |
| N-acetyl-L-hydroxyproline | Skin Essential Actives | 33996-33-7 | |
| DMSO | Nacalai tesque | 13445-45 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A7906 | |
| Tween-20 (1.1 g/mL) | Nacalai tesque | 35624-15 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21428 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21235 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Water-immersion long working distance objectives | Olympus | XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm | |
| Anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| Anti-NeuN | Millipore | ABN78 | |
| Anti-CTIP2 | Abcam | ab18465 | |
| Anti-Statb2 | Abcam | ab51502 | |
| Anti-GAD67 | Millipore | MAB5406 | |
| Anti-GABA | Sigma | A2052 | |
| Anti-Parvalbumin | Swant | 235 | |
| Anti-Parvalbumin | Frontier Institute | PV-Go-Af460 | |
| Anti-Parvalbumin | Sigma | P3088 | |
| Anti-Parvalbumin | Abcam | ab11427 | |
| Anti-Somatostatin | Peninsula Laboratories | T-4103 | |
| Anti-c-Fos | CalbioChem | PC38 | |
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