Summary

Analyse transcriptomique unicellulaire de cellules endocrines pancréatiques de souris

Published: September 30, 2018
doi:

Summary

Nous décrivons une méthode pour isoler des cellules endocrines du pancréas embryonnaires, néonatals et postnatals suivies par séquençage de RNA unicellulaires. Cette méthode permet des analyses du développement de la lignée endocrine du pancréas, de la cellule hétérogénéité et transcriptomique dynamique.

Abstract

Les cellules endocrines du pancréas, qui sont regroupées en îlots, réglementent la stabilité de glucose de sang et le métabolisme énergétique. Les types cellulaires distincts dans les îlots, y compris les cellules sécrétrices d’insuline β, sont distinguent des progéniteurs endocriniens communes durant le stade embryonnaire. Cellules endocrines immatures étendre via la prolifération cellulaire et mûrissent durant une période de développement longtemps après la naissance. Cependant, les mécanismes qui sous-tendent ces processus ne sont pas clairement définis. Unicellulaire RNA-sequencing est une approche prometteuse pour la caractérisation de populations cellulaires distincts et voies de différenciation lignée suivi cellulaire. Nous décrivons ici une méthode pour la cellule unique RNA-séquençage des cellules β du pancréas isolé du pancréas embryonnaires, néonatals et postnatals.

Introduction

Le pancréas est un organe vital métabolique chez les mammifères. Le pancréas est composé de compartiments endocrines et exocrines. Les cellules endocrines du pancréas, y compris les cellules productrices d’insuline β et cellules productrices de glucagon α, cluster ensemble dans les îlots de Langerhans et coordonnée de réguler l’homéostasie du glucose systémique. La dysfonction des cellules endocrines entraîne dans mellitus de diabète, qui est devenue un enjeu majeur de santé publique dans le monde entier.

Les cellules endocrines du pancréas sont dérivés de Ngn3+ progéniteurs au cours de l’embryogenèse1. Plus tard, durant la période périnatale, les cellules endocrines prolifèrent aux îlots immatures de forme. Ces cellules immatures continuent de développer et de devenir progressivement des îlots matures, qui deviennent richement vascularisés pour réguler l’homéostasie du glucose de sang dans les adultes,2.

Bien qu’un groupe de facteurs de transcriptionnelles a été identifié qui régulent la différenciation des cellules β, la voie précise de la maturation des cellules β est encore incertaine. En outre, le processus de maturation des cellules β comporte également la régulation de la cellule numéro expansion3,4 et la génération de l’hétérogénéité cellulaire5,6. Cependant, les mécanismes de régulation de ces processus n’ont pas été bien étudiées.

Unicellulaire RNA-sequencing est une approche puissante qui peut profil sous-populations de cellules et tracer cell lineage voies développementales7. Profitant de cette technologie, la clé des événements qui se produisent au cours du développement des îlots pancréatiques peuvent être déchiffrés au niveau unicellulaire8. Parmi les protocoles de RNA-sequencing unicellulaires, Smart-seq2 permet la génération d’ADNc pleine longueur avec une sensibilité améliorée et précision et l’utilisation des réactifs types à bas coût9. Puce-seq2 prend environ deux jours pour construire une banque d’ADNc pour séquençage10.

Ici, nous proposons une méthode pour isoler des cellules marquées fluorescence β du pancréas de foetus pour adultes de souris transgéniques Ins1-DP11, à l’aide de la cellule activée par fluorescence triant (FACS) et analyse de la performance de transcriptomique à la niveau unicellulaire, utilisant la technologie Smart-seq2 (Figure 1). Ce protocole peut être étendu pour analyser les transcriptions de tous les types de cellules endocrines pancréatiques dans les États normales, pathologiques et vieillissement.

Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Pékin. 1. pancréas isolement Pour les embryons E17.5 (embryonnaire jour 17,5) : Estimer embryonnaire jour 0,5 d’après le point dans le temps lorsque la fiche vaginale apparaît. Sacrifier les souris enceintes en CO2 administration. Vaporiser la fourrure abdominale avec 70 % d’alcool.</li…

Representative Results

Pancréas ont été disséqués souris embryonnaires, néonatals et postnatals (Figure 2 a et 2 b). Pour plus de jours après la naissance 18 souris, l’effet digestif dépend du degré de perfusion ; par conséquent, l’injection est l’étape la plus importante pour l’isolement des îlots pancréatiques (Figure 2-2E et le tableau 6). Autant collagénase …

Discussion

Dans ce protocole, nous avons démontré une méthode efficace et facile à utiliser pour étudier les profils d’expression unicellulaire des cellules β pancréatiques. Cette méthode pourrait être utilisée pour isoler les cellules endocrines du pancréas embryonnaires, néonatals et postnatals et d’effectuer des analyses transcriptomiques unicellulaires.

L’étape la plus critique est l’isolement des cellules β unique en bon état. Pancréas complètement perfusés répondent mieux…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions le Centre National pour les Sciences de la protéine, Pékin (Peking University) et le centre de Pékin-Tsinghua le Life Science Computing Platform. Ce travail a été soutenu par le ministère de la Science et technologie de la Chine (2015CB942800), la Fondation National sciences naturelles de Chine (31521004, 31471358 et 31522036) et le financement du centre de Pékin-Tsinghua pour les Sciences de la vie à C.-R.X.

Materials

Collagenase P Roche 11213873001
Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red Thermo Fisher Scientific 25200114
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone SH30071.03
Dumont #4 Forceps Roboz RS-4904
Dumont #5 Forceps Roboz RS-5058
30 G BD Needle 1/2" Length BD 305106
Stereo Microscope Zeiss Stemi DV4
Stereo Fluorescence microscope Zeiss Stereo Lumar V12
Centrifuge Eppendorf 5810R
Centrifuge Eppendorf 5424R
Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap BD-Falcon 352235
96-Well PCR Microplate Axygen PCR-96-C
Silicone Sealing Mat Axygen AM-96-PCR-RD
Thin Well PCR Tube Extragene P-02X8-CF
Cell sorter BD Biosciences BD FACSAria
Capillary pipette Sutter B100-58-10
RNaseZap Ambion AM9780
ERCC RNA Spike-In Mix Life Technologies 4456740
Distilled water Gibco 10977
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
dNTP mix New England Biolabs N0447
Recombinant RNase Inhibitor Takara 2313
Superscript II reverse transcriptase Invitrogen 18064-014
First-strand buffer (5x) Invitrogen 18064-014
DTT Invitrogen 18064-014
Betaine Sigma-Aldrich 107-43-7
MgCl2 Sigma-Aldrich 7786-30-3
Nuclease-free water Invitrogen AM9932
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) KAPA Biosystems KK2601
VAHTS DNA Clean Beads XP beads Vazyme N411-03
Qubit dsDNA HS Assay Kit Invitrogen Q32854
AceQ qPCR SYBR Green Master Mix Vazyme Q121-02
TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina Vazyme TD502 Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE
TruePrep Index Kit V3 for Illumina Vazyme TD203 Include 16 N6XX and 24 N8XX
High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit Advanced Analytical Technologies DNF-474
1x HBSS without Ca2+ and Mg2+ 138 mM NaCl; 5.34 mM KCl
4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4
0.44 mM KH2PO4
Isolation buffer 1 × HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4
FACS buffer 1 × HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4
NaCl Sigma-Aldrich S5886
KCl Sigma-Aldrich P9541
NaHCO3 Sigma-Aldrich S6297
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S5136
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G5767
HEPES Sigma-Aldrich H4034
MgCl2 Sigma-Aldrich M2393
Oligo-dT30VN primer 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3'
TSO 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3'
ISPCR primers 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'
Gapdh Forward primer 5'-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3'
Gapdh Reverse primer 5'-GCCTTGACTGTGCCGTTGAAT-3'
Ins2 Forward primer 5'-TGGCTTCTTCTACACACCCA-3'
Ins2 Reverse primer 5'-TCTAGTTGCAGTAGTTCTCCA-3'

References

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Cite This Article
Li, L., Yu, X., Zhang, Y., Feng, Y., Qiu, W., Xu, C. Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells. J. Vis. Exp. (139), e58000, doi:10.3791/58000 (2018).

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