Einzellige Transkriptomischen Analysen der Maus endokrinen Zellen der Bauchspeicheldrüse
Summary
Wir beschreiben eine Methode zur Isolierung von endokrinen Zellen aus embryonalen, Neugeborenen- und postnatale Bauchspeicheldrüsen gefolgt von einzelligen RNA Sequenzierung. Diese Methode ermöglicht Analysen der pankreatischen endokrinen Linie Entwicklung, Zell-Heterogenität und transkriptomischen Dynamik.
Abstract
Pankreatische endokrine Zellen, die in Inseln gruppiert sind, Regeln Blut-Glukose-Stabilität und Energiestoffwechsel. Die unterschiedlichen Zelltypen in Inseln, einschließlich Insulin-sezernierenden β-Zellen werden von gemeinsamen endokrine Vorfahren während der embryonalen Phase unterschieden. Unreife endokrine Zellen über Zellproliferation zu erweitern und einen lange postnatale Entwicklung Zeitraum Reifen. Allerdings sind die Mechanismen, die diese Prozesse nicht klar definiert. Einzelne Zelle RNA-Sequenzierung ist ein vielversprechender Ansatz für die Charakterisierung von unterschiedlichen Zellpopulationen und Ablaufverfolgung Zelle Abstammung Differenzierung Wege. Hier beschreiben wir eine Methode für die einzelne Zelle RNA-Sequenzierung der isolierte Pankreatische β-Zellen aus embryonalen, Neugeborenen- und postnatale Bauchspeicheldrüsen.
Introduction
Die Bauchspeicheldrüse ist eine wichtige Stoffwechselorgan bei Säugetieren. Die Bauchspeicheldrüse besteht aus endokrinen und exokrinen Fächer. Endokrine Zellen der Bauchspeicheldrüse, Insulin produzierenden β-Zellen und Glukagon produzierenden α Zellen, einschließlich cluster gemeinsam in den Langerhans-Inseln und koordinativ systemische Glukose Homöostase zu regulieren. Dysfunktion der endokrinen Zellen führt zu Diabetes Mellitus, die eine wichtige gesundheitspolitische Frage weltweit geworden ist.
Endokrine Zellen der Bauchspeicheldrüse stammen aus Ngn3+ Vorfahren während der Embryogenese1. Später, während der Perinatalperiode die endokrinen Zellen vermehren sich zu Form unreifen kleinen Inseln. Diese unreifen Zellen weiter zu entwickeln und allmählich reifer Inselchen, die reich durchblutet werden, um Blut-Glukose-Homöostase in Erwachsene2zu regulieren.
Obwohl eine Gruppe von transcriptional Faktoren, die β-Zell-Differenzierung zu regulieren identifiziert worden, ist die präzise Reifung Weg der β-Zellen noch unklar. Darüber hinaus beinhaltet der β-Zelle-Reifung auch die Regulierung der Zelle Nummer Erweiterung3,4 und die Generierung von zellulären Heterogenität5,6. Die Regulierungsmechanismen dieser Prozesse sind jedoch nicht gut untersucht worden.
Einzelne Zelle RNA-Sequenzierung ist ein leistungsfähiger Ansatz, der Zelle Subpopulationen Profil und Zelle Abstammung Entwicklungsbiologie Bahnen7verfolgen kann. Nutzen diese Technologie, die Schlüssel, die Ereignisse, die während der Entwicklung von Bauchspeicheldrüsenkrebs Inselchen auftreten bei den einzelligen Ebene8entziffert werden können. Unter den einzelligen RNA-Sequenzierung Protokolle ermöglicht Smart-seq2 die Erzeugung von in voller Länge cDNA mit verbesserte Empfindlichkeit und Genauigkeit und die Verwendung von standard Reagenzien bei niedrigeren Kosten9. Smart-seq2 dauert ungefähr zwei Tage, eine cDNA-Bibliothek für Sequenzierung10zu konstruieren.
Hier schlagen wir eine Methode zur Isolierung von Fluoreszenz-markierten β-Zellen aus den Bauchspeicheldrüsen von fetalen Erwachsenen Ins1-RFP Transgene Mäuse11, mit Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACS) und die Leistung des transkriptomischen analysiert, bei der einzellige Ebene, mit Smart-seq2 Technologie (Abbildung 1). Dieses Protokoll kann erweitert werden, um das Transkriptom alle pankreatischen endokrinen Zelltypen in normalen und pathologischen Altern Staaten zu analysieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll haben wir eine effektive und einfach zu bedienende Methode zur Untersuchung der einzelligen expressionsprofile von pankreatischer β-Zellen gezeigt. Mit dieser Methode konnte, endokrine Zellen aus embryonalen, Neugeborenen- und postnatale Bauchspeicheldrüsen zu isolieren und einzellige transkriptomischen Analysen durchzuführen.
Die wichtigste Schritt ist die Isolierung der einzelnen β-Zellen in gutem Zustand. Voll PERFUNDIERTEN Bauchspeicheldrüsen reagieren besser auf n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken die National Center für Protein Sciences, Beijing (Peking-Universität) und dem Peking-Tsinghua-Center für die Life Science-Computing-Plattform. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Ministerium für Wissenschaft und Technology of China (2015CB942800), der National Natural Science Foundation of China (31521004, 31471358 und 31522036) und Finanzierung von Peking-Tsinghua Zentrum für Life Sciences, C.-R.X.
Materials
| Collagenase P | Roche | 11213873001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Dumont #4 Forceps | Roboz | RS-4904 | |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5058 | |
| 30 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305106 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereo Fluorescence microscope | Zeiss | Stereo Lumar V12 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | BD-Falcon | 352235 | |
| 96-Well PCR Microplate | Axygen | PCR-96-C | |
| Silicone Sealing Mat | Axygen | AM-96-PCR-RD | |
| Thin Well PCR Tube | Extragene | P-02X8-CF | |
| Cell sorter | BD Biosciences | BD FACSAria | |
| Capillary pipette | Sutter | B100-58-10 | |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Life Technologies | 4456740 | |
| Distilled water | Gibco | 10977 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara | 2313 | |
| Superscript II reverse transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| First-strand buffer (5x) | Invitrogen | 18064-014 | |
| DTT | Invitrogen | 18064-014 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 107-43-7 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | AM9932 | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| VAHTS DNA Clean Beads XP beads | Vazyme | N411-03 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| AceQ qPCR SYBR Green Master Mix | Vazyme | Q121-02 | |
| TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina | Vazyme | TD502 | Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE |
| TruePrep Index Kit V3 for Illumina | Vazyme | TD203 | Include 16 N6XX and 24 N8XX |
| High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit | Advanced Analytical Technologies | DNF-474 | |
| 1x HBSS without Ca2+ and Mg2+ | 138 mM NaCl; 5.34 mM KCl 4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4 0.44 mM KH2PO4 |
||
| Isolation buffer | 1 × HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4 | ||
| FACS buffer | 1 × HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3' | ||
| TSO | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3' | ||
| ISPCR primers | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' | ||
| Gapdh Forward primer | 5'-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3' | ||
| Gapdh Reverse primer | 5'-GCCTTGACTGTGCCGTTGAAT-3' | ||
| Ins2 Forward primer | 5'-TGGCTTCTTCTACACACCCA-3' | ||
| Ins2 Reverse primer | 5'-TCTAGTTGCAGTAGTTCTCCA-3' |
References
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