Differentiering, underhåll och analys av mänskliga Retinal Pigment epitel-celler: en sjukdom-i-ett-skålen modell för BEST1 mutationer
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att skilja retinal pigment epitel (RPE) celler från mänskliga pluripotenta stamceller bär patientderiverade mutationer. De muterade cellinjer kan användas för funktionella analyser inklusive immunoblotting, immunofluorescens och patch clamp. Denna sjukdom-i-ett-skålen strategi kringgår svårigheten att få infödda mänskliga RPE-celler.
Abstract
Även om över 200 genetiska mutationer i mänskliga BEST1 -genen har identifierats och kopplade till retinala degenerativa sjukdomar, vara de patologiska mekanismerna svårfångade främst på grund av avsaknaden av en bra in-vivo -modell för att studera BEST1 och dess mutationer under fysiologiska betingelser. BEST1 kodar en jonkanal, nämligen BESTROPHIN1 (BEST1), som fungerar i pigmentepitelet (RPE); dock är ytterst begränsad tillgänglighet till infödda mänskliga RPE-celler en stor utmaning för vetenskaplig forskning. Det här protokollet beskriver hur man skapar mänskliga RPEs bär BEST1 sjukdomsframkallande mutationer av inducerad differentiering från mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs). Som hPSCs är själv förnybara, detta tillvägagångssätt tillåter forskare att ha en stadig källa till hPSC-RPEs för olika experimentella analyser, såsom immunoblotting, immunofluorescens och patch clamp, och ger därmed en mycket kraftfull sjukdom-i-ett-skålen modell för BEST1-associerade retinal villkor. Bland annat kan denna strategi användas för att studera RPE (patolo) fysiologi och andra gener av intresse inföding uttryckt i RPE.
Introduction
Det har dokumenterats som minst fem retinala degenerativa sjukdomar orsakas av genetiska mutationer BEST1 -genen1,2,3,4,5,6 , 7 , 8, med antalet rapporterade mutationer redan över 200 och fortfarande ökande. Dessa BEST1-associerade sjukdomar, även känd som bestrophinopathies, orsaka progressiv synförlust och med blindhet, och för närvarande finns det inga effektiva behandlingar. Proteinprodukter av BEST1, nämligen BESTROPHIN1 (BEST1), är en Ca2 +-aktiverade Cl– kanal (CaCC) specifikt uttryckt i pigmentepitelet (RPE) av ögonen5,6, 8,9. Ännu viktigare, en klinisk fenotyp av BEST1-associerade sjukdomar är minskad visuella svar på ljus stimuli, kallas light peak (LP) mätt i electrooculogram10,11; LP är trodde till vara medierade av en CaCC RPE12,13,14. För att bättre förstå de patologiska mekanismerna av BEST1 mutationer och att arbeta mot potentiella behandlingar, är det viktigt att studera mutant BEST1 kanaler endogenously uttryckt i mänskliga RPE-celler.
Dock att erhålla RPE-celler direkt från levande patienter är mycket opraktiskt. Även om infödda RPE-celler kan skördas från biopsier av mänskliga kadaver och foster, begränsar svårt tillgängligheten till dessa källor avsevärt vetenskaplig forskning. Därför är det avgörande att ha alternativa RPE källor än mänskliga ögon. Detta samtalet har besvarats av senaste framsteg i stamceller tekniker, som funktionell RPE-celler kan nu göras åtskillnad mellan från mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs), inklusive embryonala stamceller (hESCs) och inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs), den senare som genereras av omprogrammering primära hud fibroblaster från givare16,17,18. Ännu viktigare, säkerställer den självförnyelse och pluripotency av hPSCs en tillförlitlig källa för att generera RPEs, medan patienten-specificitet hiPSCs och genomisk modifiering potential hESCs (t.ex., av CRISPR) erbjuder en mångsidig sjukdom-i-ett-skålen modell för önskad BEST1 mutationer.
hPSC-RPE har flera fördelar jämfört med möss RPE-modeller: 1) BEST1 knockoutmöss visar inte någon retinal abnormitet19, öka möjligheten av olika genetiska kravet av BEST1 i RPE mellan möss och människor; (2) endast 3% av mänskliga RPE-celler är binucleate, i motsats till 35% i möss20; (3) hiPSC-RPE potentierar autolog transplantation i klinisk behandling av retinala sjukdomar21. Dock djurmodeller fortfarande oumbärlig för att studera RPE fysiologi och patologi i ett levande system, och hiPSC onkogen potential kan inte förbises.
Den här proceduren beskriver en användbar och måttligt enkel hPSC till RPE differentiering protokoll som kan användas för forskning och kliniska ändamål. Detta protokoll använder nikotinamid (vitamin B3) att öka differentieringen av hPSCs till nervvävnad, som vidare framkallas differentieras till RPE av behandling med activin-A. Nikotinamid behandling har visat sig öka antalet pigmenterade celler (ett tecken på differentiering in RPE), möjligen av förmildrande aktiviteten apoptotiska skilja celler22. De resulterande hPSC-RPE-cellerna Visa samma viktiga markörer, kullersten morfologi och cellulära funktioner som infödda mänskliga RPE celler22. Således i en forskning är resulterande hPSC-RPE-cellerna lämplig för nedströms funktionella analyser inklusive immunoblotting, immunfärgning och hela-cell patch clamp, som detaljerade experimentella procedurer tillhandahålls också. Kliniskt, har RPE-celler som härrör från stamceller visat stor potential för transplantation behandling av makuladegeneration i både djurstudier och mänskliga försök23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det viktigaste förfarandet för metoden sjukdom-i-ett-skålen är att differentiera hPSCs med en sjukdomsframkallande mutation till rätt cell härstamning, som är RPE för BEST1. Således, efter varje differentiering experiment, de resulterande hPSC-RPE-cellerna bör noggrant valideras för deras mogna status av RPE-specifika morfologier och protein markörer16,17,18. För att minimera klonal artefakt, bör flera hiP…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta projekt har finansierats av NIH grants EY025290, GM127652 och University of Rochester startfinansiering.
Materials
| Knock-Out (KO) DMEM | ThermoFisher | 10829018 | |
| KO serum replacement | ThermoFisher | 10829028 | |
| Nonessential amino acids | ThermoFisher | 11140050 | |
| Glutamine | ThermoFisher | 35050061 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Human activin-A | PeproTech | 120-14 | |
| MEM (a modification) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| N1 supplement | Sigma-Aldrich | N6530 | |
| Glutamine-penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | G1146 | |
| Nonessential amino acids | Sigma-Aldrich | M7156 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0386 | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T5516 | |
| mTeSR-1 medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| Trypsin | VWR | 45000-664 | |
| M-PER mammalian protein extraction reagent | Pierce | 78501 | |
| proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| RPE65 antibody | Novus Biologicals | NB100-355 | |
| CRALBP antibody | Abcam | ab15051 | |
| BEST1 antibody | Novus Biologicals | NB300-164 | |
| Beta Actin antibody | ThermoFisher | MA5-15739 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG | ThermoFisher | A-21202 | |
| Goat anti-mouse IgG | ThermoFisher | SA5-35521 | |
| Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-68071 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | 62249 | |
| HEKA EPC10 patch clamp amplifier | Warner Instruments | 895000 | |
| Patchmaster | Warner Instruments | 895040 |
References
- Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Hum Genet. 104 (6), 449-453 (1999).
- Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. Am J Hum Genet. 82 (1), 19-31 (2008).
- Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 85 (5), 581-592 (2009).
- Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. Eur J Hum Genet. 8 (4), 286-292 (2000).
- Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best’s disease). Hum Mol Genet. 7 (9), 1517-1525 (1998).
- Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nat Genet. 19 (3), 241-247 (1998).
- Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (10), 3683-3689 (2004).
- Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Mol Ther. 23 (12), 1805-1809 (2015).
- Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Boon, C. J., et al. The spectrum of ocular phenotypes caused by mutations in the BEST1 gene. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 187-205 (2009).
- Marmorstein, A. D., Cross, H. E., Peachey, N. S. Functional roles of bestrophins in ocular epithelia. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 206-226 (2009).
- Fujii, S., Gallemore, R. P., Hughes, B. A., Steinberg, R. H. Direct evidence for a basolateral membrane Cl- conductance in toad retinal pigment epithelium. Am J Physiol. 262, C374-C383 (1992).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Effects of DIDS on the chick retinal pigment epithelium. II. Mechanism of the light peak and other responses originating at the basal membrane. J Neurosci. 9 (6), 1977-1984 (1989).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. J Neurophysiol. 70 (4), 1669-1680 (1993).
- Li, Y., Nguyen, H. V., Tsang, S. H. Skin Biopsy and Patient-Specific Stem Cell Lines. Methods Mol Biol. 1353, 77-88 (2016).
- Milenkovic, A., et al. Bestrophin 1 is indispensable for volume regulation in human retinal pigment epithelium cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2630-E2639 (2015).
- Moshfegh, Y., et al. BESTROPHIN1 mutations cause defective chloride conductance in patient stem cell-derived RPE. Hum Mol Genet. 25 (13), 2672-2680 (2016).
- Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1’s essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. Elife. 6, (2017).
- Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). J Gen Physiol. 127 (5), 577-589 (2006).
- Volland, S., Esteve-Rudd, J., Hoo, J., Yee, C., Williams, D. S. A comparison of some organizational characteristics of the mouse central retina and the human macula. PLoS One. 10 (4), e0125631 (2015).
- Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
- Idelson, M., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells. Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).
- Mandai, M., et al. Autologous Induced Stem-Cell-Derived Retinal Cells for Macular Degeneration. N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
- Maruotti, J., et al. A simple and scalable process for the differentiation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 2 (5), 341-354 (2013).
- Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nat Commun. 4, 2540 (2013).
- Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), 18213-18218 (2014).
- Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346 (6207), 355-359 (2014).
- Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. PLoS One. 7 (5), e37079 (2012).
- Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T., Colecraft, H. M. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nat Chem Biol. 3 (12), 795-804 (2007).
- Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V., Colecraft, H. M. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. J Physiol. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).
- Gong, J., et al. Differentiation of Human Protein-Induced Pluripotent Stem Cells toward a Retinal Pigment Epithelial Cell Fate. PLoS One. 10 (11), e0143272 (2015).
- Zhang, Y., et al. ATP activates bestrophin ion channels through direct interaction. Nat Commun. 9 (1), 3126 (2018).
