Análise das células do epitélio do pigmento da retina humana, diferenciação e manutenção: um modelo de doença-em-um-prato de mutações BEST1

Tem sido documentado pelo menos cinco doenças degenerativas da retina causadas por mutações genéticas no BEST1 gene^{1,2,3,4,5,6 , 7 , 8}, com o número de mutações relatadas já mais de 200 e ainda crescente. Estes BEST1-doenças associadas, também conhecido como bestrophinopathies, causam perda de visão progressista e até mesmo cegueira, e há atualmente nenhum tratamento eficaz. O produto proteico de BEST1, nomeadamente BESTROPHIN1 (BEST1), é um Ca^{2 +}-canal de Cl^– ativado (CaCC) especificamente expressado no epithelium retinal do pigment (RPE) dos olhos^{5,6, 8,9}. Importante, um fenótipo clínico de BEST1-doenças associadas é a reduzida resposta visual aos estímulos de luz, chamado de pico de luz (LP) medido no eletrooculograma^10,11; LP é acreditado para ser mediada por um CaCC RPE^12,13,14. Para melhor compreender os mecanismos patológicos de mutações BEST1 e trabalhar no sentido de terapias potenciais, é essencial estudar mutante BEST1 canais endogenamente expressados em células humanas de RPE.

No entanto, obter o RPE células diretamente de pacientes ao vivo é altamente impraticável. Embora as células RPE nativas podem ser colhidas de biópsias de cadáveres humanos e fetos, o difícil acesso a essas fontes limita significativamente a investigação científica. Portanto, é essencial dispor de fontes alternativas de RPE diferente de olhos humanos. Esta chamada foi atendida pelos recentes avanços nas técnicas de células-tronco, como as células RPE funcionais agora podem ser diferenciadas de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs), incluindo células-tronco embrionárias (hESCs) e induzida por células estaminais pluripotentes (hiPSCs), este último sendo gerada pela reprogramação de fibroblastos da pele primária de doadores^16,17,18. Importante, a auto-renovação e pluripotência de hPSCs certifique-se de uma fonte confiável para gerar RPEs, enquanto a paciente-especificidade de hiPSCs e potencial de modificação do genoma de hESCs (por exemplo, por CRISPR) oferecem um modelo de doença-em-um-prato versátil para mutações de BEST1 desejadas.

hPSC-RPE tem várias vantagens sobre ratos modelos RPE: 1) ratos do KO BEST1 não exibem qualquer anormalidade da retina¹⁹, levantando a possibilidade de exigência genética diferente de BEST1 no RPE entre ratos e humanos; 2) apenas 3% de células humanas de RPE são binucleate, em contraste com 35% em ratos²⁰; 3) hiPSC-RPE potencializa transplante autólogo na clínica tratamento de retina distúrbios²¹. No entanto, modelos animais são ainda indispensáveis para estudar RPE fisiologia e patologia em um sistema ao vivo, e o potencial oncogênica de hiPSC não pode ser esquecido.

O procedimento aqui descreve um hPSC moderadamente simples e útil para o protocolo de diferenciação RPE que pode ser usado para fins clínicos e de pesquisa. Este protocolo utiliza a nicotinamida (vitamina B3) para aumentar a diferenciação de hPSCs tecido neural, que mais é induzida a se diferenciar em RPE pelo tratamento com a União. Tratamento de nicotinamida foi mostrado para aumentar o número de células pigmentadas (sinal de diferenciação em RPE), possivelmente se atenuar a atividade apoptotic de diferenciar células²². As células resultantes do hPSC-RPE exibem a mesmas chaves marcadores, morfologia de paralelepípedos e funcionalidade celular como nativo humano RPE células²². Assim, em um ambiente de pesquisa, as células de RPE-hPSC resultante são adequadas para análises funcionais a jusante, incluindo immunoblotting, imunocoloração e braçadeira do remendo de célula inteira, para que procedimentos experimentais detalhados também são fornecidos. Clinicamente, as células RPE derivadas de células-tronco têm mostrado grande potencial para o tratamento de transplante de degeneração macular em estudos com animais e testes em humanos de²³.