Summary
Her presenterer vi en protokoll for å skille netthinnens pigment epitel (RPE) celler fra menneskelige pluripotent stamceller bærer pasient-avledede mutasjoner. De muterte cellelinjer kan brukes for funksjonell analyser inkludert immunoblotting, immunofluorescence og patch klemme. Denne sykdommen-i-en-fat omgår vanskelighetene med å skaffe innfødt menneskelige RPE celler.
Abstract
Selv om over 200 genetiske mutasjoner i menneskelig BEST1 genet har blitt identifisert og knyttet til netthinnens degenerative sykdommer, forblir patologisk mekanismer unnvikende skyldes i hovedsak mangel på en god i vivo modell for å studere BEST1 og dens mutasjoner under fysiologiske forhold. BEST1 koder en ion kanal, nemlig BESTROPHIN1 (BEST1), som fungerer i netthinnens pigment epitel (RPE); men representerer svært begrenset tilgang til innfødte menneskeceller RPE en stor utfordring for vitenskapelig forskning. Denne protokollen beskriver hvordan å generere menneskelige RPEs bærer BEST1 sykdom-forårsaker mutasjoner av indusert differensiering fra menneskelige pluripotent stamceller (hPSCs). Som hPSCs er selv fornybar, denne tilnærmingen lar forskere har en jevn kilde til hPSC-RPEs for ulike eksperimentelle analyser, som immunoblotting, immunofluorescence og patch klemme, og dermed gir en svært kraftig sykdom-i-en-fat modell for BEST1-forbundet retinal forhold. Spesielt kan denne strategien brukes for å studere RPE (patho) fysiologi og andre gener rundt innfødt uttrykt i RPE.
Introduction
Det er dokumentert at minst fem netthinnens degenerative sykdommer er forårsaket av genetiske mutasjoner i BEST1 gen1,2,3,4,5,6 , 7 , 8, med antall rapporterte mutasjoner allerede over 200 og fortsatt økende. Disse BEST1-tilknyttede sykdommer, også kjent som bestrophinopathies, forårsake progressive synstap og med blindhet, og det finnes ingen effektiv behandling. Protein produktet av BEST1, nemlig BESTROPHIN1 (BEST1), er en Ca2 +-aktivert Cl- kanal (CaCC) spesielt uttrykt i netthinnens pigment epitel (RPE) øyne5,6, 8,9. Viktigst, en klinisk fenotypen av BEST1-tilknyttede sykdommer er redusert visuelle svaret lett stimuli, kalt lys peak (LP) målt i electrooculogram10,11; LP antas å være formidlet av en CaCC i RPE12,13,14. For å bedre forstå patologisk mekanismer for BEST1 mutasjoner og arbeide mot potensielle terapi, er det viktig å studere mutant BEST1 kanaler endogenously uttrykt i menneskelig RPE celler.
Men å skaffe RPE celler direkte fra live pasienter er svært upraktisk. Selv om opprinnelig RPE celler kan høstes fra biopsies av menneskelige levningene og fostre, grenser vanskelig tilgang til disse kildene betydelig forskning. Derfor er det avgjørende å ha alternative RPE kilder enn menneskelige øyne. Denne samtalen er blitt besvart av nylige fremskritt i stamcelleforskningen teknikker, funksjonelle RPE celler kan nå være differensiert fra menneskelige pluripotent stamceller (hPSCs), inkludert embryonale stamceller (hESCs) og indusert pluripotent stamceller (hiPSCs), sistnevnte blir generert av omprogrammering primære hud fibroblaster givere16,17,18. Viktigere, sikre selvtillit fornyelse og pluripotency av hPSCs en pålitelig kilde for å generere RPEs, mens pasienten-spesifisiteten av hiPSCs og genomisk endring potensialet i hESCs (f.eksved CRISPR) tilbyr en allsidig sykdom-i-en-fat modell for ønsket BEST1 mutasjoner.
hPSC-RPE har flere fordeler sammenlignet med mus RPE modeller: 1) BEST1 knockout mus viser ikke noen retinal abnormitet19, øke muligheten for ulike genetisk krav av BEST1 i RPE mellom mus og mennesker; 2) bare 3% av menneskelige RPE celler er binucleate, i motsetning til 35% i mus20; 3) hiPSC-RPE potentiates autolog transplantasjon i klinisk behandling av retinal lidelser21. Likevel dyremodeller er fortsatt uunnværlig for å studere RPE fysiologi og patologi i et live system, og kreftfremkallende potensialet i hiPSC ikke kan overses.
Fremgangsmåten her beskriver en nyttig og moderat enkel hPSC RPE differensiering protokollen som kan brukes for forskning og klinisk. Denne protokollen bruker nikotinamid (vitamin B3) å styrke differensiering av hPSCs til nevrale vev, som er videre indusert å differensiere i RPE av behandling med activin-A. Nikotinamid behandling har vist seg å øke antall pigmentert celler (et tegn på differensiering inn RPE), muligens av demping apoptotisk aktiviteten skille celler22. De resulterende hPSC-RPE-cellene vise samme viktige indikatorer, brosteinsbelagte morfologi og cellulære funksjoner som innfødt menneskelige RPE celler22. Dermed i en forskning er de resulterende hPSC-RPE-cellene egnet for nedstrøms funksjonelle analyser inkludert immunoblotting, immunostai- og hele celle oppdateringen klemme, som detaljert eksperimentelle prosedyrer tilbys også. Klinisk har RPE celler avledet fra stamceller vist stort potensial for transplantasjon behandling av makuladegenerasjon i både dyrestudier og menneskelige studier23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. differensiering av hPSC til RPE
- Opprettholde og passasje hPSCs som tidligere beskrevet18.
Merk: Alle celler (inkludert hPSCs og hPSC-RPEs) er dyrket i 37 ° C på 5% CO2 hele varigheten av vekst og differensiering protokoller. -
Før differensiering, delt confluent hPSCs til pre belagt 6-og plater.
- Pels plater, tine kjelleren membran matrise på isen i ca 1 time, suspendere liquidized matrise i 4 ° C DMEM medium på en 1:50 fortynning, legge til 800 µL belegg blandingen i hver brønn og ruge minst 1t på 37 ° C.
- Når belegg er fullført, Sug opp blandingen og umiddelbart legge til 1,5-2 mL medium i brønnene.
- For å løfte hPSCs fra gamle kultur platene, ruge celler med PBS pluss 0,5 mM EDTA i 5 minutter ved romtemperatur, Sug opp løsningen og resuspend celler i små klumper med kultur medium.
- Frø celler på ~ 20% confluency i de nye platene.
Merk: Lagre kjelleren membran matrise i 100 µL dele på 20 ° C og bruke en aliquot til coat en 6-vel plate. Tiden for belegg kan utvides opp til 4 h på 37 ° C eller over natten i romtemperatur. Det er viktig å suspendere og frø hPSCs som små klumper av 3 – 5 celler stedet for enkeltceller.
- Når cellene er vokst til full confluency, erstatte kultur medium med differensiering medium (4 mL/vel) (tabell 1, uten activin-A). Kultur i 14 dager, endre medium (4 mL/vel) 3 x / week.
Merk: HPSC plate tetthet Double ca hver 24 h. betydelig celledød forventes etter starten av differensiering prosedyren. Aggregater av døde celler og rusk i brønnene kan ses med det blotte øye under middels endringer. - Fra dag 15 dag 28, supplement differensiering medium med 100 ng/mL human activin-A (tabell 1, med human activin-A). Endre medium (4 mL/vel) 3 x / week.
- Stopp activin-et tilskudd på dag 29 (tabell 1, uten menneskelig activin-A). Fortsette celle dyrking i differensiering medium for 8-10 uker til pigmentert hPSC-RPE klynger vises (figur 1A-B).
Merk: Klynger av pigmentert celler kan sees som små mørke prikker på en celle kultur plate av det blotte øye (figur 1A-B, topp). Pigmentert enkeltceller signatur brosteinsbelagte figuren ses under 20 X mikroskop (figur 1A-B, bunnen).
2. isolering og kultur differensiert RPE celler
- Fjerne differensiering medium, vask en gang med PBS, legge til 1 mL av 0,05% trypsin pluss 1 U/µL av collagenase i hver brønn, og ruge på 37 ° C i 20-30 min. Fjern trypsin/collagenase og forsiktig legge 2 mL forvarmes RPE medium i hver brønn av 6-vel plate (< C0 > tabell 2).
Merk: Bruk en invertert mikroskop overvåke morfologi av hPSC-RPE celler som er mangekantet før trypsin/collagenase behandling, og bli runde etter tilstrekkelig fordøyelsen. -
Bruk en Bunsen brenner å trekke glass Pasteur pipetter.
- Med begge hender, holde en lang (9 tommer) Pasteur Pipetter i begge ender så det er vannrett, og over Bunsen brenner omtrent 2/3 ned lengden på den tynne delen av pipette.
- Når glasset blir myke fra flammen, raskt trekke de to endene fra hverandre, slik at en mikro skraper-lignende tips er dannet på nye slutten av Pipetter (figur 2).
- Gjenta flere ganger for å opprette flere "cell skrapere". Spray de trakk Pipetter med 70% etanol for sterilisering og air-dry dem i celle kultur panseret.
-
Under et mikroskop, bruke en mikro "celle skrape" å forsiktig dissociate pigmentert hPSC-RPE klynger fra platen.
- Forsiktig tapper (ikke skrape) direkte på pigmentert cellene, som flyter opp til kultur medium når de dissociate fra bunnen av brønnen.
- Umiddelbart bruke 20 µL brønnene forsiktig enkel sugeevnen avstand hPSC-RPE-celler og overføre dem til en pre belagt 6-vel plate med RPE middels24.
- Samle ~ 5 x 103 celler (~ 10% confluency observert under 20 X mikroskop) i hver pre-belagt godt av en 12-vel-plate ved å gjenta trinn 2.3.1–2.3.2 flere ganger, etter behov. Bringe det siste bindet av medium 2 mL.
Merk: For å forhindre avstand hPSC-RPE celler fra flytende, unngå bevegelse av platene under dissosiasjon prosessen slik at dissosiert cellene er flytende i medium men fortsatt lokalt konsentrert.
- Kultur nylig isolerte hPSC-RPE celler (P0) på 12-vel plater i RPE medium for en annen 6-8 uker å tillate dem å danne en pigmentert monolayer (figur 1 c).
- Endre mediet 3 x / week. Når du endrer medium, la ca 1/3 volumet av gamle mediet i hver brønn, og legge til 2/3 volumet av frisk, forvarmes RPE medium. På dette stadiet, bruker 2 mL RPE medium for hver brønn i en 12-vel plate (dermed utveksle 1.3 mL av medium hver gang).
Merk: Monolayer P0 hPSC-RPE celler kan danne kupler, antyder at cellene er aktivt transportere væsker, og er forankret fast veikryss25. Derfor er dome-formasjonen en indikator på eldre RPE status.
3. RPE skjebne validering av Immunoblotting
- Lage hPSC-RPE cellen lysate bruker pattedyr protein utvinning buffer med proteinasen hemmer cocktail. Inkuber cellen lysate på isen i 30 min før sentrifugering 13.000 x g i 15 min på 4 ° C forkaste fra ikke celle rusk. Mål den totale protein konsentrasjonen av lysate.
- Denature 40 µg totale protein Laemmli SDS eksempel buffer ved 75 ° C for 10 min. Separate protein eksempler på en 10% Tris-glycine SDS side gel med en konstant spenning på 90 V for 15 min og deretter 150 V til den fargestoff forside når bunnen av gel.
- Overføre proteiner på en nitrocellulose membran i pre-avkjølt Tris-glycine buffer med 10% metanol 100 V 1t.
- Blokkere membranen i Tris bufret saltvann med 0,1% ikke-ioniske vaskemiddel (TBST) og 5% ikke-fett tørr melk 1t ved romtemperatur.
- Inkuber membranen med primære antistoffer fortynnet i blokkering bufferen på 4 ° C over natten. Fortynne antistoffer målretting RPE bestemt markør proteiner som følger: RPE65, 1:1, 000; CRALBP, 1:1, 000; BEST1, 1:1, 000. Fortynne antistoffer mot β-utgangen på 1:10,000 å oppdage β-utgangen som en lasting.
- Vask membranen med TBST 3 ganger, med 5 minutter for hver vask.
- Inkuber membranen fluorophore konjugert geit anti-mus IgG sekundære antistoff fortynnet 1:10,000 blokkerer buffer 1t ved romtemperatur.
- Vask membranen med TBST 4 ganger, med 10 min for hver vask.
- Oppdage proteiner ved hjelp av en infrarød imaging system (Figur 3).
4. kontrollere BEST1 Subcellular lokalisering av immunostai-
- Vask hPSC-RPE-celler med 2 mL PBS gang og fikse i 2 mL 4% paraformaldehyde i 45 min ved romtemperatur.
- Vask med 2 mL PBS to ganger, og ruge cellene i 2 mL PBS med 0,1% ikke-ioniske surfactant og 2% esel serum for 45 min blokkere ikke-spesifikk bindende områder.
- Inkuber cellene med BEST1 antistoffer (1:200 fortynning) for 2 timer ved romtemperatur.
- Vask cellene med 2 mL PBS 3 ganger. Inkuber med fluorophore konjugert sekundære IgG (1:1, 000) 1t ved romtemperatur.
- Vask med 2 mL PBS 3 ganger å fjerne ubundet sekundære antistoff.
- Observere farget celler av AC confocal mikroskopi (Figur 4).
5. opptak Ca2 +-avhengige Cl- -gjeldende i hPSC-RPE av hele celle Patch klemme
- 24-72 h før oppdateringen klemmen, dele et fullt confluent (på en 12-vel plate) av modne P0 hPSC-RPE celler (brosteinsbelagte-formet og pigmentert). Sug opp den medium, vaske gang med PBS, og legge 1 mL av 0,05% trypsin pluss 1 U/µL collagenase i brønnen.
Merk: Forvarme av trypsin/collagenase 37 ° c rett før bruk. - Ruge på 37 ° C i 8 min.
Merk: Etter dette trinnet, hPSC-RPE-celler er fortsatt tilhenger og tilkoblet. - Bruk 1 mL brønnene forsiktig vaske cellene av platen, og overføre celler i fordøyelsen blandingen til en 15 mL konisk rør. Vask brønnen med 1 mL av forvarmes trypsin/collagenase å samle de gjenværende cellene og kombinere dem til 15 mL konisk røret.
Merk: HPSC-RPE cellene er fortsatt i store klumper på dette punktet. Ikke prøv å bryte celle klumper av energisk pipettering. Noen klumper kan holde seg til den indre veggen i 1 mL spissen. - Inkuber konisk røret i 37 ° C tørr badekar i 8 min.
- Bruk 1 mL brønnene å forsiktig pipette opp 10-15 ganger fordøyelsen mix.
Merk: Cellen klumper blitt mye mindre, men fortsatt synlig. Unngå kraftig pipettering. - Gjenta de forrige to trinnene.
Merk: De fleste cellene skal være i én celle suspensjon etter pipettering. Det kan fremdeles noen lille cellen klumper, som er akseptabelt. Valgfritt: Ruge konisk røret ved 37 ° C i en ekstra 5 min etterfulgt av mild pipettering. Totaltiden i trypsin/collagenase på 37 ° C bør ikke overstige 30 min (8 + 8 + 8 + 5 = 29). - Legge til 5 mL forvarmes RPE middels 15 mL konisk røret som inneholder fordøyd cellene. Spinn på 200 x g i 5 min å samle cellene. Nytt suspendere og frø celler i pre belagt 35 mm retter på 10-20% confluency (f.eks, en 100% confluent på en 12-vel plate fem 35 mm retter for 10% confluency).
Merk: Hele tiden, unngå kraftig pipettering, som kan forårsake betydelig celledød representert ved tilsynelatende mørke celle rusk i nedbryting etter sentrifugering. Godt atskilt encellede seeding er viktig for oppdateringen klemme opptak. - Utføre hele celle oppdateringen klemme som beskrevet tidligere18,26,27,28,29,30,31. Skaffe gjeldende spor fra en familie av trinn potensialer (100 til 100 mV fra et holde potensial 0 mV) (figur 5).
Merk: Oppskrifter på interne og eksterne løsninger er beskrevet i tabell 3 og Tabell 4, henholdsvis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det mest teknisk utfordrende trinnet er Manuell isolasjon, som har som mål å oppnå høy renhet av differensiert P0 hPSC-RPE innbyggere. Etter en vellykket isolasjon, > 90% celler i befolkningen P0 vil vokse og modnes vise signatur RPE morphologies (figur 1 c). Eksistensen av en mindre del av ikke-RPE eller umodne RPE celler i befolkningen P0 er nesten uunngåelig, men forstyrre ikke nedstrøms eksperimenter så lenge antall pigmentert og brosteinsbelagte-formet hPSC-RPE celler er overveldende flertallet.
Med hPSC-RPE basert sykdom-i-en-fat tilnærming, kan hver pasient-spesifikke BEST1 mutasjon være omfattende preget i vivo for protein uttrykket (immunoblotting, Figur 3), membran menneskehandel ( immunostaining, Figur 4), og kanal Ionefunksjonen (hele celle oppdateringen klemme, figur 5). Disse resultatene gir viktig informasjon for Klargjørende patologisk mekanismer for kanal mutasjoner og utvikle personlige medisin.
Som BEST1 er hovedsakelig uttrykt i RPE celler, kan den brukes som en mobil markør for å validere statusen for eldre RPE. Det bør bemerkes at noen BEST1 mutasjoner kan påvirke sitt protein uttrykk, så andre veletablerte RPE markører som RPE65 og CRALBP trenger å bli vurdert (Figur 3).
Modnet P0 hPSC-RPE celler kan vedlikeholdes for 2-3 måneder før deling (til P1) for hele celle oppdateringen klemme. P0 cellene eldre enn 3 måneder er ikke anbefalt for oppdateringen klemme, men fortsatt brukes for immunoblotting og immunostai-eksperimenter.
Figur 1: differensiert hPSC-RPE celler på ulike stadier. Representant bilder av pigmentert hPSC-RPE-klynger i kultur plater på første opptreden (A), før isolasjon (B) og etter vekst til forfall legge isolasjon (C). Øye-visning og 20 X fase kontrast bilder vises i toppen og bunnen panelene, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representativt bilde av mikro celle skrapen trakk fra en Pasteur pipette. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: validering av eldre RPE status differensiert hPSC-RPE celler av immunoblotting. Blots viser uttrykk for RPE-spesifikke protein markører BEST1, RPE65 og CRALBP i WT hPSC og hPSC-RPE celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Immunostaining av BEST1 i WT hPSC-RPEs. (A) representant immunofluorescent bilder viser den membran lokaliseringen av WT BEST1 i brosteinsbelagte-formet hPSC-RPE celler. (B) Immunostaining negativ kontroll utelate BEST1 primære antistoffer.
Figur 5: hele celle oppdateringen klemme opptak av hPSC-RPEs. (A) A enkelt hPSC-RPE-cellen for hele celle oppdateringen klemme. (B) representant gjeldende spor spilt inn fra en BEST1 WT hPSC-RPE og en BEST1 mutert hPSC-RPE på topp Ca2 +. Spenning protokollen for strøm vises i innsatsen. Skala bar = 1 nA, 150 ms. se tabellene 3 og Tabell 4 for oppdateringen klemme forberedelse detaljer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Reagens | Beløp |
| Knock-Out (KO) DMEM | 500 mL |
| KO serum erstatning | 15% (75 mL) |
| Unødvendige aminosyrer | 1% (5 mL) |
| Glutamin | 1% (5 mL) |
| Penicillin-streptomycin | 1% (5 mL) |
| Nikotinamid | 10 mM |
| Menneskelige activin-A * | 100 ng/mL |
| * Human activin-A er supplert i løpet av 15-28 differensiering protokollen. | |
Tabell 1: RPE differensiering Medium.
| Reagens | Beløp |
| MEM (α modifisering) | 500 mL |
| Fosterets bovin Serum | 5% (25 mL) |
| N1 supplement | 1% (5 mL) |
| Glutamin penicillin streptomycin | 1% (5 mL) |
| Unødvendige aminosyrer | 1% (5 mL) |
| Taurin | 125 mg |
| Hydrocortisone | 10 µg |
| Triiodo-thyronin | 0.0065 µg |
Tabell 2: RPE kultur Medium.
| Reagens | Konsentrasjon |
| CsCl | 130 mM |
| MgCl2 | 1 mM |
| EGTA | 10 mM |
| Magnesium ATP | 2 mM |
| HEPES (pH 7.4) | 10 mM |
| CaCl2* | Varierer |
| Glukose ** | ~ 5 mM |
| * Legge til CaCl2 for å få ønsket Ca2 + konsentrasjon | |
| ** Bruk glukose justere osmolaritet til 290-295 mOsm/L | |
Tabell 3: Patch klemme intern løsning.
| Reagens | Konsentrasjon |
| NaCl | 140 mM |
| KCl | 5 mM |
| MgCl2 | 1 mM |
| CaCl2 | 2 mM |
| HEPES (pH 7.4) | 10 mM |
| Glukose * | ~ 5 mM |
| * Bruk glukose justere osmolaritet til 300-305 mOsm/L. | |
Tabell 4: Patch klemme eksterne løsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Viktigste prosedyren for sykdom-i-en-fat tilnærming er å skille hPSCs med en sykdom-forårsaker mutasjon i riktig celle arverekken, som er RPE for BEST1. Dermed etter hver differensiering eksperiment, bør de resulterende hPSC-RPE-cellene nøye validert sin eldre status RPE-spesifikke morphologies og protein markører16,17,18. For å minimere klonal gjenstand, bør flere hiPSC kloner fra samme pasient eller flere hESC kloner med samme mutasjonen brukes når det er mulig.
Både hiPSC og hESC kan differensieres til RPE med samme protokoll. hiPSCs med eller uten en mutasjon i BEST1 genet kan omprogrammeres fra huden fibroblaster BEST1 pasienter eller sunn givere, henholdsvis. hESCs bærer en mutasjon i BEST1 kan være genetisk konstruert fra foreldre hESC linje, som har vill-type (WT) BEST1. HiPSC-RPE og hESC-RPE rutene har sine egne fordeler og ulemper. Førstnevnte er mer pasient-spesifikke og klinisk relevante, spesielt til personlig medisin. Det er imidlertid verdt å merke seg at det er flere begrensninger for hiPSC-RPE tilnærming: 1) det er logistisk vanskelig å få tilgang til et fullt spekter av BEST1 pasientprøvene, donasjoner fra pasienter kan ikke alltid gis, og noen mutasjoner er svært sjeldne i første omgang; 2) ikke-spesifikk fenotyper kan skyldes ulik genetisk bakgrunn og fysiske forholdene av givere; 3) i hiPSC til RPE differensiering effektivitet varierer for ulike givere, slik at noen tilfeller kan være teknisk utfordrende for å få hiPSC-RPEs. På den annen side, hESC-RPE rute, selv om mer kunstige, tilbyr en allsidig plattform for å generere isogenic hESC-RPEs ønsket mutasjoner på forespørsel for ikke-partisk funksjonelle undersøkelser.
Eldre RPE celler er pigmentert, mangekantet og forbindelser med stramme knutepunktene i en monolayer. Etter dele i en enkelt celle befolkningen for oppdateringen klemme, vil ferske reseeded hPSC-RPE-celler miste mangekantede figuren, men beholde pigmentering i flere dager (figur 5A). Oppdateringen klemmen er utført 24-72 h etter celle deling, der tiden pigmentering kan fortsatt brukes som en synlig markør velge celler med god RPE status. En mild celle delt resulterer i et flertall av godt atskilt enkeltceller uten betydelige celledød er nøkkelen til suksess av oppdateringen klemmen.
Flere andre differensiering protokoller ved hjelp av ulike celle kultur medier og vekst faktorer er dokumentert i den litteratur21,32. Tiden som kreves for differensiering av hPSC til RPE ligner på alle disse protokollene inkludert vår, mens det er vanskelig å si om det er ingen vesentlig forskjell i differensiering effektivitet uten en side-ved-side-sammenligning. Det bør bemerkes at i den gjeldende protokollen, hPSC-RPE celler er dyrket i vanlig flat bunnplater, men ikke på plater med membran inserts, så hPSC-RPE som genereres av denne fremgangsmåten ikke kan best er recapitulate polariteten til RPE celler i vivo. Derfor er teknikkene ovenfor mest egnet en forskning innstillingen33, selv om de genererte hPSC-RPE-cellene kan også kultivert i Transwell platene til skjemaet monolayer RPE ark for klinisk formål17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Prosjektet ble finansiert ved NIH tilskudd EY025290, GM127652 og Universitetet i Rochester oppstart finansiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knock-Out (KO) DMEM | ThermoFisher | 10829018 | |
| KO serum replacement | ThermoFisher | 10829028 | |
| Nonessential amino acids | ThermoFisher | 11140050 | |
| Glutamine | ThermoFisher | 35050061 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Human activin-A | PeproTech | 120-14 | |
| MEM (a modification) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| N1 supplement | Sigma-Aldrich | N6530 | |
| Glutamine-penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | G1146 | |
| Nonessential amino acids | Sigma-Aldrich | M7156 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0386 | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T5516 | |
| mTeSR-1 medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| Trypsin | VWR | 45000-664 | |
| M-PER mammalian protein extraction reagent | Pierce | 78501 | |
| proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| RPE65 antibody | Novus Biologicals | NB100-355 | |
| CRALBP antibody | Abcam | ab15051 | |
| BEST1 antibody | Novus Biologicals | NB300-164 | |
| Beta Actin antibody | ThermoFisher | MA5-15739 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG | ThermoFisher | A-21202 | |
| Goat anti-mouse IgG | ThermoFisher | SA5-35521 | |
| Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-68071 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | 62249 | |
| HEKA EPC10 patch clamp amplifier | Warner Instruments | 895000 | |
| Patchmaster | Warner Instruments | 895040 |
References
- Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Hum Genet. 104 (6), 449-453 (1999).
- Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. Am J Hum Genet. 82 (1), 19-31 (2008).
- Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 85 (5), 581-592 (2009).
- Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. Eur J Hum Genet. 8 (4), 286-292 (2000).
- Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best's disease). Hum Mol Genet. 7 (9), 1517-1525 (1998).
- Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nat Genet. 19 (3), 241-247 (1998).
- Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (10), 3683-3689 (2004).
- Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Mol Ther. 23 (12), 1805-1809 (2015).
- Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Boon, C. J., et al. The spectrum of ocular phenotypes caused by mutations in the BEST1 gene. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 187-205 (2009).
- Marmorstein, A. D., Cross, H. E., Peachey, N. S. Functional roles of bestrophins in ocular epithelia. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 206-226 (2009).
- Fujii, S., Gallemore, R. P., Hughes, B. A., Steinberg, R. H. Direct evidence for a basolateral membrane Cl- conductance in toad retinal pigment epithelium. Am J Physiol. 262, C374-C383 (1992).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Effects of DIDS on the chick retinal pigment epithelium. II. Mechanism of the light peak and other responses originating at the basal membrane. J Neurosci. 9 (6), 1977-1984 (1989).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. J Neurophysiol. 70 (4), 1669-1680 (1993).
- Li, Y., Nguyen, H. V., Tsang, S. H. Skin Biopsy and Patient-Specific Stem Cell Lines. Methods Mol Biol. 1353, 77-88 (2016).
- Milenkovic, A., et al. Bestrophin 1 is indispensable for volume regulation in human retinal pigment epithelium cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2630-E2639 (2015).
- Moshfegh, Y., et al. BESTROPHIN1 mutations cause defective chloride conductance in patient stem cell-derived RPE. Hum Mol Genet. 25 (13), 2672-2680 (2016).
- Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1's essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. Elife. 6, (2017).
- Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). J Gen Physiol. 127 (5), 577-589 (2006).
- Volland, S., Esteve-Rudd, J., Hoo, J., Yee, C., Williams, D. S. A comparison of some organizational characteristics of the mouse central retina and the human macula. PLoS One. 10 (4), e0125631 (2015).
- Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
- Idelson, M., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells. Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).
- Mandai, M., et al. Autologous Induced Stem-Cell-Derived Retinal Cells for Macular Degeneration. N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
- Maruotti, J., et al. A simple and scalable process for the differentiation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 2 (5), 341-354 (2013).
- Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nat Commun. 4, 2540 (2013).
- Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), 18213-18218 (2014).
- Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346 (6207), 355-359 (2014).
- Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. PLoS One. 7 (5), e37079 (2012).
- Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T., Colecraft, H. M. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nat Chem Biol. 3 (12), 795-804 (2007).
- Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V., Colecraft, H. M. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. J Physiol. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).
- Gong, J., et al. Differentiation of Human Protein-Induced Pluripotent Stem Cells toward a Retinal Pigment Epithelial Cell Fate. PLoS One. 10 (11), e0143272 (2015).
- Zhang, Y., et al. ATP activates bestrophin ion channels through direct interaction. Nat Commun. 9 (1), 3126 (2018).
