差別化、保守、および人間の網膜色素上皮細胞の解析: BEST1変異の皿での疾患モデル

それは、少なくとも 5 つの網膜変性疾患がBEST1遺伝子^1,2,3,4,5,6遺伝子の突然変異によって引き起こされるを記載されています。^,7,8、200 と依然として増加を既に報告された突然変異の数。これらのBEST1-準の病気として知られている bestrophinopathies、進歩的な視野の損失と、さらには失明を引き起こすし、効果的な治療法は現在ありません。BEST1、すなわち BESTROPHIN1 の蛋白質の製品 (BEST1) は Ca^{2 +}-アクティブ Cl^-チャネル (CaCC) 目^{5,6、網膜色素上皮 (RPE) に特異的に発現 8,9}。BEST1の重要な臨床表現型-関連疾患は眼球電図^10,11; 測定光ピーク (LP) と呼ばれる、光の刺激に減らされた視覚反応LP は RPE^12,13,14CaCC によって媒介されると考えられています。BEST1の突然変異の病理メカニズムをよりよく理解するために、潜在的な治療に向けてに取り組む、内生人間の網膜色素上皮細胞に発現変異の BEST1 チャンネルの勉強は必須です。

ただし、取得 RPE ライブ患者から直接細胞はない非常に実用的です。ネイティブの網膜色素上皮細胞は、人間の死体と胎児のバイオプシーから収穫されることが、これらの情報源に困難なアクセシビリティは大幅に、科学的な研究を制限しています。したがって、代替の RPE ソース以外の人間の目を持つことが重要です。この呼び出しは、幹細胞技術の最近の進歩によって回答されている網膜色素上皮細胞の機能が今ひと多能性幹細胞 (hPSCs) を含む萌芽期の幹細胞 (hESCs) から区別することができ、誘導多能性幹細胞 (hiPSCs)、後者リプログラミング ドナー^16,17,18からプライマリ皮膚線維芽細胞によって生成されています。重要なは、自己更新と hPSCs の多能性確保 hiPSCs の患者特異性と hESCs (例えば、CRISPR によって) のゲノムの変更可能性の多彩な料理での疾患モデルを提供しています RPEs を生成する信頼性の高いソース目的のBEST1の突然変異。

hPSC RPE マウス RPE モデル上のいくつかの利点がある: 1) BEST1ノックアウト マウスの網膜異常¹⁹マウスとヒトの間 RPE でBEST1のさまざまな遺伝的要件の可能性を高めるを表示しません。2) 人間の網膜色素上皮細胞の 3% がマウス²⁰; 35% と対照をなして、嬢だけ3) による網膜色素上皮移植の臨床を促進する網膜の治療疾患²¹。しかし、動物モデルがまだライブ システムに RPE の生理学と病理学を勉強するために不可欠である、ことの発癌性を見落すことができません。

ここでの手順では、研究と臨床目的のため使用することができます網膜色素上皮分化プロトコルに役に立つと適度に単純な hPSC について説明します。このプロトコルでは、ナイアシン (ビタミン B3) を使用して、hPSCs、RPE への分化誘導アクチビン A と治療に起因するさらに神経組織への分化を増強セル²²を差別化のアポトーシス活性を減衰させることによってして、ニコチンアミド治療を色素細胞 (RPE への分化の記号) の数を増やす可能性が示されています。結果の hPSC 網膜色素上皮細胞は、ネイティブひと網膜色素上皮細胞²²として同じキー マーカー、石畳の形態と細胞機能を表示します。したがって、研究の設定で、結果の hPSC 網膜色素上皮細胞は、法、免疫染色と細胞パッチクの詳細な実験手順は提供されていますを含む下流の機能解析に適しています。臨床的に、幹細胞由来網膜色素上皮細胞は、動物試験とひと試験²³の黄斑変性症の移植治療のための大きな可能性を示しています。

1. hPSC RPE への分化

1. 維持し、通路 hPSCs 前述した¹⁸。
   注: (hPSC RPEs、hPSCs など) のすべてのセル成長および微分のプロトコルの期間中 5% CO₂ 37 ° C で育ちます。
2. 分化する前にあらかじめコーティング 6 ウェル プレートに合流 hPSCs を分割します。
   1. コート プレート、約 1 時間の氷の上の基底膜マトリックスを解凍、1:50 で 4 ° C DMEM 培地における液状化・行列を停止に希釈、各ウェルに 800 μ L コーティング混合物を追加し、37 ° C で少なくとも 1 時間インキュベート
   2. コーティングが完了したら、混合物を吸引し、すぐに井戸に 1.5-2 mL の培地を追加します。
   3. 古い培養皿から hPSCs を持ち上げる、室温で 5 分間 PBS プラス 0.5 ミリメートルの EDTA、細胞を孵化させなさい、ソリューションを吸引、培養培地に小さな塊の細胞を再懸濁します。
   4. 新しい板で 〜 20% の confluency シード細胞。
      注:-20 ° C で 100 μ 因数で基底膜マトリックスし 6 ウェル プレートに塗るに 1 つの因数を利用します。コーティングのための時間は、37 ° c、または一晩室温で 4 h まで拡張できます。中断し、単一のセルではなく、3-5 細胞の小さな塊として hPSCs をシードすることが重要です。
3. 細胞がフルの confluency に成長できたら、置き換える培分化培地 (4 mL/ウェル) (表 1、アクチビンなし-A)。文化 14 日間 (4 mL/ウェル) 媒体を変更する 3 x/週。
   注: hPSC プレート密度ダブルス約すべての 24 h. 重要な細胞死は、微分の手続きの開始後期待されます。死んだ細胞や井戸に破片の集合体は、中程度の変更時に肉眼で見ることができます。
4. 28 日目に、15 日から 100 ng/mL 人間アクチビン A (表 1アクチビン A の人間) と分化培地を補足します。媒体 (4 mL/も) を変更 3 回/週。
5. 日 29 (表 1、人間アクチビン A なし) にアクチビン A 補給を停止します。8-10 週間色素 hPSC RPE クラスターが表示される (図 1 aB) まで分化培地で培養を続けます。
   注: 色素細胞のクラスターは細胞培養プレート上に小さな暗い点として (図 1 a ・B、トップ)、肉眼で見ることが。署名の玉石の形状と個々 の色素細胞は (図 1 a・ B下) 20 X 顕微鏡下で見ることができます。

2. 分離と差別化された RPE 細胞の培養

1. 分化培地を取り除き、PBS で 1 回洗浄、0.05% トリプシン プラス 1 U/μ L を各ウェルにコラゲナーゼの 1 mL を加えると, 20-30 分削除トリプシン/コラゲナーゼの 37 ° C で、軽く 6 ウェル プレートの各ウェルに予め温めておいた RPE 媒体の 2 mL を追加 ( テーブル 2)。
   注: 倒立顕微鏡を使用してトリプシン/コラゲナーゼ処理前に多角形である hPSC RPE 細胞の形態を監視するなり充分な消化後ラウンド。
2. プル ガラス パスツール ピペットにブンゼン バーナーを使用します。
   1. 両手で両端水平方向だとブンゼン バーナーの上に長い (9 インチ) パスツール ピペットを保持、ピペットの薄い部分の長さを約 2/3。
   2. ガラスは炎からソフトになると、すぐに引き離し 2 つの端、マイクロのスクレーパーのような先端が新しいピペット (図 2) 末に形成されることなど。
   3. 複数「細胞スクレーパー」を作成するために数回をを繰り返します。70% のエタノールの殺菌と引っ張られたピペットをスプレーし、細胞文化フードでそれらを空気乾燥します。
3. 顕微鏡、マイクロ「細胞スクレーパー」を使用して、優しくプレートから色素 hPSC RPE クラスターを分離します。
   1. 軽く (こすりしない) 直接色素細胞のある、フロートを培地に一度井戸の底から彼らを切り離して考えます。
   2. すぐに 20 μ L マイクロ ピペットを使用して、優しく解離 hPSC-網膜色素上皮細胞を吸引、RPE の中の²⁴のプレコート 6 ウェル プレートにそれらを転送するため。
   3. 複数回、必要に応じて 2.3.1–2.3.2 の手順を繰り返すことによって 12 ウェル プレートのプレコート各 5 〜 10 の³セル (~ 10% の confluency 20 X 顕微鏡下で観察) x を収集します。2 mL に媒体の最終巻をもたらします。
      注: 解離 hPSC RPE を防ぐために浮遊細胞で動きを避けるためプレートの解離過程の中に解離細胞培地に浮遊しているローカル集中のままが。
4. RPE 中色素分子 (図 1) を形成するための別の 6-8 週間 12 ウェル プレートに培養新たに単離した hPSC 網膜色素上皮細胞 (P₀)。
5. 3 媒体を変更 x/週。メディアを変更すると、各ウェルに古い媒体の約 1/3 量を残すし、新鮮な予め温めておいた RPE 培地 2/3 量を追加します。この段階で 12 ウェル プレートの各ウェルの RPE 培地 2 mL を使用して (したがって、交換中の 1.3 mL たび)。
   注: P₀ hPSC 網膜色素上皮細胞の単層細胞が積極的に、流体を輸送するいるとタイトジャンクショ²⁵によって固定されます、ドームを形成できます。したがって、ドーム形成は成熟 RPE ステータスのインジケーターです。

3. イムノブロット RPE 運命検証

1. カクテルを作る hPSC 網膜色素上皮細胞ライセート プロテアーゼ阻害剤を添加した哺乳類タンパク質抽出バッファーを使用してください。不溶細胞の残骸を破棄する 4 ° C で 15 分間 13,000 × gで遠心分離前に 30 分間氷の上細胞ライセートを孵化させなさい。ライセートの総蛋白濃度を測定します。
2. 変性 40 μ g 75 ° C で塩化物イオンと SDS サンプルバッファーの総蛋白質の 10 分別の蛋白質のサンプル 15 分、染料のフロントに達するまで 150 V、90 V の定電圧で 10% トリス-グリシンの SDS ページのゲルのゲルの底。
3. 1 h の 100 V で 10% メタノールを添加した予冷のトリス-グリシン バッファー内の硝酸セルロースの膜に蛋白質を転送します。
4. 0.1% 非イオン性洗剤 (TBST) と室温で 1 時間 5% 脱脂乾燥したミルクでトリス緩衝生理食塩水の膜をブロックします。
5. 一晩で 4 ° C ブロック バッファーで希釈した一次抗体と細胞膜を孵化させなさい。網膜色素上皮特異的マーカー蛋白質を次のようにターゲット抗体を希釈: RPE65、1:1, 000CRALBP、1:1, 000BEST1 は、1:1, 000。ローディング コントロールとして β-アクチンを検出する 1: 10,000 で β-アクチン抗体を希釈します。
6. TBST の 3 回、各洗浄のため 5 分で膜を洗浄します。
7. Fluorophore 共役ヤギ抗マウス IgG 抗体希釈 1: 10,000 室温で 1 時間ブロッキング バッファー内で膜を孵化させなさい。
8. TBST 4 回、各洗浄のため 10 分で膜を洗浄します。
9. 赤外線システム (図 3) を用いたタンパク質を検出します。

4. 免疫染色による細胞内局在 BEST1 をチェックします。

1. 1 回 2 ml の PBS の hPSC 網膜色素上皮細胞を洗浄し、常温で 45 分 4% パラホルムアルデヒドの 2 mL で修正します。
2. 2 mL の PBS で 2 回洗うし、0.1% 非イオン性界面活性剤と 2% ロバ血清非特異的結合部位をブロックする 45 分の 2 mL の PBS のセルを孵化させなさい。
3. 室温で 2 h の BEST1 抗体 (希釈 1: 200) 細胞を孵化させなさい。
4. 2 ml の PBS 3 回の細胞を洗浄します。孵化 fluorophore 共役二次 IgG (1:1, 000) 室温で 1 時間。
5. 非連結の二次抗体を削除する PBS 3 回 2 mL で洗います。
6. 共焦点顕微鏡 (図 4) によるステンド グラスの細胞を観察します。

5. 記録 Ca^{2 +}-hPSC-RPE 細胞パッチク ランプでの Cl^-現在の依存

1. 24-72 時間、パッチク ランプ、前に分割 (玉石形や色素)、完全に合流も (12 ウェル プレート) に成熟した P₀ hPSC 網膜色素上皮細胞の。、Pbs 中、洗って一度を吸引し、井戸に 0.05% トリプシン プラス 1 U/μ L コラゲナーゼの 1 mL を追加します。
   注: 事前使用直前の 37 ° C にトリプシン/コラゲナーゼを温めます。
2. 8 分 37 ° C で孵化させなさい。
   注: この手順後 hPSC 網膜色素上皮細胞がまだ付着性細胞と接続しています。
3. 水洗いして、プレートからセルに 1 mL ピペットを使用し、消化混合物内のセルを 15 mL の円錐管に転送します。予め温めておいたトリプシン/コラゲナーゼ残留細胞を収集し、それらを組み合わせて 15 mL の円錐管に 1 mL でよく洗ってください。
   注: hPSC 網膜色素上皮細胞が大きな塊でまだこの時点で。積極的なピペッティングにより細胞塊を破るしないでください。いくつかの塊が 1 mL 先端の内側の壁に固執します。
4. 8 分間 37 ° C の乾燥浴で円錐形の管を孵化させなさい。
5. 1 mL ピペット ピペットをゆっくり上下に 10-15 回消化ミックスを使用します。
   注: セルの塊は、まだ目に見えるが、ずっと狭くなった。積極的なピペッティングを避けてください。
6. 前の 2 つの手順を繰り返します。
   注: 細胞の大部分は、ピペッティングした後単一細胞懸濁液にする必要があります。受け入れているいくつかの小さな細胞塊はまだあります。オプション: 穏やかなピペッティングに続いてさらに 5 分間 37 ° C で円錐形の管を孵化させなさい。37 ° C でトリプシン/コラゲナーゼの合計時間 30 分 (8 + 8 + 8 + 5 = 29) を超えてはなりません。
7. 消化細胞を含む 15 mL コニカル チューブに予め温めておいた RPE 培地 5 mL を追加します。200 x のg細胞を収集するために 5 分で回転します。10-20% の confluency にプレコート 35 mm 料理に再中断と種子の細胞 (例えば100% 10% の confluency 5 35 mm 皿に 12 ウェル プレートにも合流)。
   注: すべての回で避けるため積極的なピペッティング、遠心分離後の上清の明白な暗い細胞の残骸によって表される、重要な細胞死をさせることがあります。十分に分離単一セルのシードは、パッチ ・ クランプ記録のために不可欠です。
8. 全細胞パッチを実行^{18,26,27,28,29,30,31}を前述のようにクランプします。ステップ電位の家族から現在のトレースを取得 (+100、-100 0 の開催可能性から mV mV) (図 5)。
   注: 内部と外部のソリューションのレシピそれぞれ表 3 表 4で説明されます。

差別化された P₀ hPSC RPE 人口の高純度を達成するためにめざす手動分離の最も技術的に挑戦的なステップです。成功した分離後 > P₀人口の 90% の細胞が成長し、成熟署名 RPE 形態 (図 1) を表示します。RPE 非または P₀人口の未熟な網膜色素上皮細胞のマイナーな部分の存在はほぼ避けられないが、下流の実験と干渉しない限り、発色が良くて、石畳状 hPSC 網膜色素上皮細胞の数が圧倒的大半は。

総合的に特徴づけられる生体内でタンパク質発現 (免疫ブロット、図 3)、膜人身売買 (することができます hPSC RPE ベース料理での疾患アプローチBEST1にある各患者特有の変異免疫染色、図 4)、およびイオン チャネル機能 (全細胞パッチク ランプ、図 5)。これらの結果は、チャネルの変異の病理メカニズムを解明するため、個別化医療を開発するための重要な情報を提供します。

BEST1 は、主に網膜色素上皮細胞で表されますとは、成熟した RPE 状態の検証のための細胞マーカーとして使用できます。RPE65 と CRALBP まだ必要するなど他の確立された RPE マーカー評価 (図 3) BEST1変異可能性がありますその蛋白質の表現に影響を与えることに留意。

成熟した P₀ hPSC 網膜色素上皮細胞は、細胞パッチク ランプのための (₁) に分割する前に 2-3 か月保持ことができます。P₀セル 3 か月より古いパッチク ランプには推奨されませんが、法と免疫染色実験のため使用できます。

図 1: さまざまな段階で hPSC 網膜色素上皮細胞を分化します。初登場 (A)、(B) の分離前に、と成長と成熟後の培養皿で色素 hPSC RPE クラスターの代表的なイメージの記事 (C) を分離。20 X 位相コントラスト画像と目のビューは、それぞれ上部と下部のパネルに表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: マイクロ細胞スクレーパーの代表的なイメージはパスツール ピペットからプルします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: イムノブロットによる細胞分化 hPSC RPE の成熟 RPE 状態の検証します。しみ WT hPSC と hPSC 色素上皮細胞における RPE 特定蛋白質のマーカー BEST1、RPE65、および CRALBP の発現を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4: WT hPSC RPEs で BEST1 の免疫染色。(A) 代表的な蛍光画像玉石形 hPSC 網膜色素上皮細胞の WT BEST1 の膜のローカリゼーションを示します。(B) 免疫染色は負 BEST1 の一次抗体を省略するコントロールです。

図 5: hPSC RPEs の全細胞パッチ クランプ録音します。全細胞パッチク ランプの A (A) 単一 hPSC RPE 細胞。(B) 代表的な現在純化BEST1 WT hPSC-RPE とBEST1から変異でピーク Ca^{2 +}hPSC RPE です。挿入に電流を引き出すため電圧のプロトコルを示します。スケール バー 1 nA = 150 さんを参照表 3と表 4パッチ用クランプ準備詳細。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

表 1: 網膜色素上皮分化培地。

表 2: RPE 培。

表 3: パッチ クランプ内部ソリューションです。

表 4: パッチ クランプ外部ソリューションです。

病気の料理方法の最も重要な手順は、 BEST1の RPE の正しいセル血統に病気の原因となる変異を有する hPSCs を区別することです。したがって、各分化実験後結果の hPSC 網膜色素上皮細胞慎重によって検証されるべきの成熟状態の RPE 固有の形態とタンパク質マーカー^16,17,18。クローン アーチファクトを最小限に抑えるために同じ患者から複数によるクローンまたは同じ変異を有する複数の hESC クローン使用してください可能な限り。

HESC の線は、同じプロトコルで RPE に区別できます。hiPSCs BEST1遺伝子の突然変異の有無は、それぞれ BEST1 患者や健康なドナーの皮膚線維芽細胞から書き換えることができます。hESCs BEST1 の突然変異を軸受は、野生型 (WT) BEST1 を持つ親 hESC 行から遺伝子組み換えできます。自分の長所と短所による網膜色素上皮と悪名高く RPE のルートがあります。前者はより患者固有および個別化医療に特に、臨床的に関連します。しかし、こと RPE のアプローチのいくつかの制限があることは注目に値するだ: 1) ロジスティックと患者からの寄付を与え常にことはできません、いくつかの突然変異は非常にBEST1患者サンプルの完全なスペクトルにアクセスすることは困難です。最初の場所では珍しい2) 非特定の表現型はドナーの身体状況と異なる遺伝的背景から生じる3) による網膜色素上皮分化効率にはいくつかのケースは、こと RPEs を取得する技術的に困難なことができるように異なるドナーによって異なります。一方、悪名高く RPE ルートが人工的な非バイアス機能調査の需要に必要な遺伝子変異を有する同質 hESC RPEs を生成する汎用性の高いプラットフォームを提供しています。

成熟した網膜色素上皮細胞は、色素、多角形、および単分子層のタイトな接合で接続されています。パッチク ランプのための単一のセル人口を分割後新鮮な再 seed hPSC-網膜色素上皮細胞は多角形の形状を失うことが数日間 (図 5 a) 色素沈着はまだ保持します。パッチク ランプは、時間の間に色素使用できます表示マーカーとして良い RPE 状態でセルを選択するセルの分割後の実行の 24-72 h です。重要な細胞死がなければ十分に分離の単一セルの大半で、その結果を分割穏やかなセルは、パッチ クランプの成功への鍵です。

別の細胞培養媒体および成長因子を使用していくつかの他の微分のプロトコルは、文学^21,32で記載されています。HPSC RPE への分化に必要な時間は、サイド ・ バイ ・ サイド比較なし分化効率に有意な差があるかを伝えるは難しいですが、我々 を含むすべてのこれらのプロトコルに似ています。現在のプロトコルの hPSC 網膜色素上皮細胞は、通常のフラット底板がない板膜を挿入して、このプロシージャで生成 hPSC RPE を最高要約がないので網膜色素上皮の極性細胞体内に留意。したがって、生成された hPSC-網膜色素上皮細胞を臨床目的¹⁷単分子膜網膜色素上皮シートを形成する Transwell プレートで培養もできますが、上記の手法は研究設定³³、ほとんど適しています。