Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להבדיל תאים (RPE) אפיתל הפיגמנט ברשתית תאי גזע pluripotent האנושי הנושאים מוטציות נגזר החולה. הקווים המוטנטים תא עשוי לשמש עבור ניתוחים פונקציונליים כולל immunoblotting, immunofluorescence, תיקון קלאמפ. גישה זו מחלה-ב--תבשיל עוקף את הקושי של השגת תאי RPE אדם מקורי.
Abstract
למרות מעל 200 מוטציות גנטיות הגן האנושי BEST1 מזוהה, קשורה מחלות ניווניות של הרשתית, המנגנונים פתולוגיים נשארים חמקמק בעיקר בשל היעדר מודל טוב ויוו ללמוד BEST1 מוטציות שלה בתנאים פיזיולוגיים. BEST1 מקודד ערוץ יון, כלומר BESTROPHIN1 (BEST1), אשר מתפקד באפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE); עם זאת, הנגישות מוגבלת מאוד מקורית תאי RPE אדם מייצג אתגר למחקר מדעי. פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור אנושי RPEs הנושאת BEST1 גורמי מחלות מוטציות על ידי בידול המושרה מתאי גזע pluripotent אנושי (hPSCs). כפי hPSCs עצמית מתחדשת, גישה זו מאפשר לחוקרים יש מקור יציב של hPSC-RPEs עבור ניתוח ניסיוני שונים, כגון immunoblotting, immunofluorescence, תיקון קלאמפ, ובכך מספק מודל המחלה-ב--מאכל חזק מאוד BEST1-הקשורים לתנאי ברשתית. ראוי לציין, אסטרטגיה זו ניתן להחיל ללמוד פיזיולוגיה RPE (פתו) ו אחרות הגנים של עניין הביעו באופן מקורי ב- RPE.
Introduction
זה תועד כי לפחות חמישה מחלות ניווניות ברשתית נגרמות על ידי מוטציות גנטיות BEST1 ג'ין1,2,3,4,5,6 , 7 , 8, עם המספר של מוטציות שדווחה כבר מעל 200, הגדלת עדיין. אלה BEST1-הקשורים במחלות, הידוע גם בשם bestrophinopathies, לגרום אובדן ראייה מתקדמת ועיוורון אפילו, ויש כיום אין טיפולים יעילים. המוצר חלבון של BEST1, כלומר BESTROPHIN1 (BEST1), היא Ca2 +-מופעל ערוץ Cl– (CaCC) במיוחד לידי ביטוי אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) של העיניים5,6, 8,9. חשוב, פנוטיפ קליני של BEST1-מחלות המשויך הוא התגובה חזותי מופחתת לגירויים קלים, שנקרא שיא אור (LP) נמדד10,' electrooculogram '11; LP הוא האמין בתיווכו CaCC RPE12,13,14. על מנת להבין טוב יותר את המנגנונים פתולוגי של מוטציות BEST1 , לפעול לקראת טיפולים פוטנציאליים, זה חיוני ללמוד מוטציה ערוצי BEST1 endogenously לידי ביטוי תאי RPE אדם.
עם זאת, קבלת RPE תאים ישירות מחולים חיים אינה מעשית מאוד. למרות תאי RPE יליד ובביצים ביופסיות של גופות אדם, העוברים, הנגישות המקורות הללו קשה מגבילה באופן משמעותי מחקר מדעי. לכן חשוב וקריטי. שיהיה מקורות חלופיים RPE מלבד העיניים האנושיות. שיחה זו נענתה על ידי הפיתוחים האחרונים בתחום תאי הגזע טכניקות, כמו תאי RPE פונקציונלי עכשיו ניתן להבחין מן האדם גזע pluripotent (hPSCs), כולל תאי גזע עובריים (hESCs) ואת המושרה גזע pluripotent (hiPSCs), האחרון שיוצר התכנות fibroblasts העור העיקרי של תורמים16,17,18. חשוב, התחדשות עצמית pluripotency של hPSCs על מנת להבטיח מקור אמין כדי ליצור RPEs, בעוד המטופל-יחודיות של hiPSCs ופוטנציאל השינוי גנומית של hESCs (למשל, על-ידי CRISPR) מציעים מודל המחלה-ב--תבשיל רב-תכליתי עבור מוטציות BEST1 הרצוי.
hPSC-RPE יש כמה יתרונות על פני עכברים RPE מודלים: 1) עכברים knockout BEST1 אינם מציגים כל סטייה ברשתית19, מעלים את האפשרות של דרישה גנטית שונה של BEST1 ב RPE בין בעכברים ובבני אדם; 2) יש רק 3% של תאי RPE אדם binucleate, לעומת 35% בעוד עכברים20; 3) hiPSC-RPE potentiates עצמיים השתלת ב קליניים לטיפול רשתית הפרעות21. בכל זאת, בבעלי חיים הם עדיין חיוני ללמוד RPE פיזיולוגיה, פתולוגיה במערכת בשידור חי, הפוטנציאל oncogenic של hiPSC. אי אפשר להתעלם.
ההליך פה מתאר של hPSC יעיל ופשוט למדי לפרוטוקול בידול RPE יכול לשמש למטרות מחקר ומטרות קליניים. פרוטוקול זה משתמש nicotinamide (ויטמין B3) כדי להגדיל את הבידול של hPSCs על רקמה עצבית, אשר בהמשך הנגרמת להבדיל לתוך RPE על ידי טיפול עם activin-א טיפול Nicotinamide הוכח להגדיל את מספר תאי פיגמנט (סימן של בידול לתוך RPE), ואולי על-ידי attenuating הפעילות אפופטוטיים להיפגע להבדיל תאים22. התאים hPSC-RPE וכתוצאה מכך מציגים את סמני מפתח אותו, מורפולוגיה המרוצף והפונקציונליות הסלולר יליד האנושי RPE תאים22. לפיכך, בסביבה מחקר, התאים hPSC-RPE וכתוצאה מכך מתאימים לפי הזרם ניתוחים פונקציונליים כולל immunoblotting, immunostaining, תיקון שלם-תא קלאמפ, שעבורו הליכים ניסיוני מפורטים ניתנים גם. קלינית, תאי RPE שמקורם בתאי גזע הראו פוטנציאל גדול לטיפול השתלת של ניוון מקולרי מחקרים שנעשו בבעלי חיים והן בניסויים בבני אדם23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בידול של hPSC כדי RPE
- לשמור על, מעבר hPSCs שתואר קודם לכן גם18.
הערה: כל התאים (כולל hPSCs hPSC-RPEs) גדלים 37 ° C-5% CO2 לאורך משך הפרוטוקולים בהתפתחותם. -
לפני בידול, פיצול hPSCs confluent ללוחות 6-ובכן מצופים מראש.
- מעיל צלחות, להפשיר קרום המרתף מטריקס על קרח לשעה בערך, להשעות את מטריקס liquidized בינוני DMEM 4 ° C-1:50 דילול, הוסף תערובת ציפוי µL 800 מכל קידוח ולאחר תקופת דגירה של פחות שעה ב 37 º C.
- עם השלמת ציפוי, וארוקן את התערובת ולהוסיף מיד mL 1.5 – 2 בינוני לתוך הבארות.
- להרים hPSCs מן הלוחות התרבות העתיקה, דגירה תאים עם EDTA PBS פלוס 0.5 מ מ עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, וארוקן את הפתרון, resuspend תאים במקבצים קטנים עם תרבות בינוני.
- תאי הזרע ב ~ 20% confluency על לוחית הרשיון החדש.
הערה: לאחסן קרום המרתף מטריקס aliquots 100 µL ב-20 ° C ולהשתמש aliquot אחד מעיל צלחת 6-. טוב. הפעם לציפוי ניתן להרחיב עד 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, או למשך הלילה בטמפרטורת החדר. חשוב להשעות ולהפעיל זרע hPSCs כמו גושים קטנים של 3-5 תאים ולא תאים בודדים.
- כאשר תאים בוגרים כדי confluency מלאה, להחליף את המדיום תרבות בידול בינונית (4 מ ל/טוב) (טבלה 1, מבלי activin-A). תרבות למשך 14 ימים, שינוי המדיום (4 מ ל/טוב) 3 x / שבוע.
הערה: hPSC צלחת צפיפות לזוג כ ה 24 כל מוות של תאים משמעותי צפוי לאחר תחילת ההליך בידול. אגרגטים של תאים מתים ופסולת בתוך הבארות ניתן לראות בעין בלתי מזוינת במהלך שינויים בינוני. - מיום 15 יום 28, תוספת בידול בינוני עם 100 ננוגרם למ"ל האדם activin-A (טבלה 1, עם האדם activin-A). לשנות את המדיום (4 מ ל/טוב) 3 x / שבוע.
- להפסיק activin-A תוספי החל ביום 29 (טבלה 1, ללא האדם activin-A). המשך תא culturing בידול בינוני במשך 8-10 שבועות עד hPSC פיגמנט-RPE אשכולות יופיעו (איור 1 א'-ב').
הערה: אשכולות של תאי פיגמנט ניתן לראות נקודות קטנות כהה על צלחת תרבות תא בעין בלתי מזוינת (איור 1 א'-ב', למעלה). ניתן לראות תאים פיגמנט בודדים עם הצורה המרוצף חתימה תחת מיקרוסקופ X 20 (איור 1 א'-ב', התחתון).
2. בידוד והתרבות של תאי RPE הבדיל
- להסיר את המדיום בידול, לשטוף פעם עם PBS, להוסיף 1 מ"ל של טריפסין 0.05% בתוספת 1 U µL של collagenase בכל טוב, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20-30 דקות הסרה טריפסין/collagenase ואת בעדינות מוסיפים 2 מ"ל של מדיום RPE מראש ומחוממת לבאר כל צלחת 6-ובכן (< c0 > בטבלה 2).
הערה: השתמש במיקרוסקופ הפוך כדי לפקח על המורפולוגיה של תאי hPSC-RPE, אשר מצולע לפני הטיפול טריפסין/collagenase, ולהיות עגול לאחר עיכול מספיקות. -
השתמש מבער בונזן לזכוכית למשוך פסטר סיליקון.
- בשתי הידיים, להחזיק ארוך (9 אינץ) פסטר פיפטה בשני קצותיו אז זה אופקי ומעל את מבער בונזן בערך 2/3 לאורך כל החלק דק פיפטה.
- ברגע הזכוכית הופך רך מהאש, במהירות להפריד את שני הקצוות, כך טיפ מגרד כמו מיקרו נוצר בסוף חדש פיפטה (איור 2).
- לחזור מספר פעמים כדי ליצור מספר "מגרדים תאים". לרסס את משך פיפטות עם אתנול 70% עבור עיקור, מילה נהדרת אותם בשכונה התרבות תאים.
-
תחת מיקרוסקופ, להשתמש במיקרו "תא המגרד" בעדינות מביצועם hPSC פיגמנט-RPE אשכולות מהצלחת.
- טפח בעדינות (לא לגרד) ישירות על תאי פיגמנט, אשר יצוף למעלה לתוך האמצעי תרבות ברגע שהם מביצועם מתחתית הבאר.
- באופן מיידי להשתמש של micropipette 20 µL בעדינות לשאוב תאי RPE-hPSC הפומבית ולהעביר אותם ל צלחת 6-ובכן מצופים מראש עם RPE בינונית24.
- לאסוף ~ 5 x3 10 תאים (~ 10% confluency כפי שנצפו תחת מיקרוסקופ X 20) בכל אחד מראש מצופה היטב של צלחת 12-ובכן חוזרת צעדים 2.3.1–2.3.2 מספר פעמים, לפי הצורך. להביא את הנפח הסופי של בינוני 2 מ"ל.
הערה: כדי למנוע הפומבית hPSC-RPE תאים צף משם, להימנע התנועה של הלוחות במהלך תהליך דיסוציאציה כך התאים dissociated צפים במדיום אך עדיין יישארו מרוכזים באופן מקומי.
- תרבות hPSC-RPE לאחרונה מבודד התאים (P0) על צלחות 12-ובכן RPE בינוני עוד 6-8 שבועות לאפשר להם להקים פיגמנט חד שכבתי (איור 1C).
- לשנות את המדיום 3 x / שבוע. בעת שינוי של המדיום, להשאיר כ- 1/3 כמות המדיום הישן מכל קידוח, ולהוסיף 2/3 כמות בינונית RPE טריים, ומחוממת מראש. בשלב זה, השתמש 2 מיליליטר RPE בינוני במשך כל בצלחת 12-ובכן (לכן, המרת מ 1.3 ל בינונית בכל פעם).
הערה: טפט של P0 hPSC-RPE תאים עשויים בצורת כיפות, רומז כי התאים באופן פעיל מעבירים נוזלים, מעוגנות צמתי צר25. לכן, היווצרות הכיפה הוא מחוון מצב RPE בוגרת.
3. RPE אימות גורל על-ידי Immunoblotting
- להפוך את hPSC-RPE התא lysate באמצעות מאגר החילוץ בתרבית של חלבון בתוספת proteinase מעכב קוקטייל. דגירה התא lysate על קרח למשך 30 דקות לפני צנטריפוגה ב x 13,000 g למשך 15 דקות ב 4 ° C כדי למחוק את שאריות תאים undissolved. מודדים את ריכוז חלבון סך של lysate.
- Denature 40 µg של חלבון הכולל במאגר מדגם Laemmli מרחביות ב 75 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות להפריד בין החלבון דוגמאות על טריס-גליצין מרחביות-דף 10% ג'ל על מתח קבוע של 90 V במשך 15 דקות ולאחר מכן 150 V עד מגיע קבלה צבען התחתון של הג'ל.
- להעביר את החלבונים על גבי קרום ניטרוצלולוזה במאגר טרום מקורר טריס-גליצין, בתוספת 10% מתנול ב- 100 וולט לשעה.
- לחסום את הקרום בתוך תמיסת מלח טריס באגירה מלאה עם סבון ללא יונית 0.1% (TBST) ו- 5% שומן חלב יבש לשעה בטמפרטורת החדר.
- דגירה הקרום עם נוגדנים העיקרי מדולל במאגר חסימה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לדלל את הנוגדנים מיקוד חלבונים ספציפיים סמן RPE כדלקמן: RPE65, 1:1, 000; CRALBP, 1:1, 000; BEST1, 1:1, 000. לדלל הנוגדן נגד β-אקטין-1:10,000 כדי לזהות β-אקטין כפקד טעינה.
- לשטוף את הקרום עם TBST 3 פעמים, עם 5 דקות עבור כל כביסה.
- דגירה הקרום עם fluorophore עז מצומדת אנטי-העכבר IgG 1:10,000 נוגדנים משניים מדולל במאגר החסימה לשעה בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את הקרום עם TBST 4 פעמים, עם 10 דקות עבור כל כביסה.
- לזהות את החלבונים באמצעות אינפרא הדמיה מערכת (איור 3).
4. בדיקת לוקליזציה Subcellular BEST1 על ידי Immunostaining
- לשטוף hPSC-RPE תאים עם 2 מ של PBS פעם ותקן ב 2 מ של 4% paraformaldehyde למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף עם 2 מ של PBS פעמיים, דגירה התאים 2 מ של PBS עם 0.1% ללא יונית חומרים פעילי שטח ו- 2% חמור בסרום למשך 45 דקות לחסום את האתרים שאינם ספציפיים מחייב.
- דגירה התאים עם נוגדנים BEST1 (דילול 1:200) עבור 2 h בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את התאים עם 2 מ של PBS 3 פעמים. דגירה עם fluorophore מצומדת משני IgG (1:1, 000) לשעה בטמפרטורת החדר.
- לשטוף עם 2 מ של PBS 3 פעמים כדי להסיר נוגדנים משניים לא מאוגד.
- להתבונן תאים מוכתם על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית (איור 4).
5. הקלטה Ca2 +-זרם התלויים Cl– hPSC-RPE באמצעות מלחציים תיקון שלם-תא
- 24-72 שעות לפני המלחציים תיקון, לפצל מלא confluent היטב (על צלחת 12-טוב) של התאים hPSC-RPE0 P בוגרים (בצורת המרוצף פיגמנט). האחות פעם אחת בינונית, תשטוף עם PBS, ולהוסיף 1 מ"ל של טריפסין 0.05% בתוספת 1 U/µL collagenase לתוך הבאר.
הערה: לחמם את טריפסין/collagenase עד 37 ° C לפני השימוש. - דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 8 דקות.
הערה: לאחר שלב זה, hPSC-RPE התאים הם עדיין חסיד ומחובר. - השתמש micropipette 1 מ"ל לשטוף בעדינות את התאים מהצלחת ולאחר להעביר תאים בתערובת עיכול צינור חרוטי 15 מ"ל. לשטוף היטב עם 1 מ"ל של טריפסין ומחוממת מראש/collagenase כדי לאסוף את התאים שיורית לשלב אותם לתוך הצינור חרוט 15 מ"ל.
הערה: התאים hPSC-RPE הם עדיין במקבצים גדולים בשלב זה. אל תנסו לשבור כגיהנום תא על-ידי pipetting נמרצת. כמה גושים עשויים לדבוק החומה הפנימית של קצה 1 מ"ל. - דגירה הצינור חרוט באמבט יבש 37 מעלות צלזיוס במשך 8 דקות.
- השתמש micropipette 1 מ"ל ל בעדינות פיפטה שיהיה 10 – 15 פעמים המיקס לעיכול.
הערה: תא גושים להיות הרבה יותר קטן אבל עדיין גלויים. להימנע pipetting נמרצת. - חזור על שני השלבים הקודמים.
הערה: רוב התאים צריך להיות בתא יחיד ההשעיה לאחר pipetting. עדיין ייתכנו כמה גושים לצינוק, אשר מקובלים. אופציונלי: דגירה הצינור חרוט ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות נוספות ואחריו pipetting עדין. הזמן הכולל של טריפסין/collagenase ב 37 מעלות צלזיוס לא יעלה על 30 דקות (8 + 8 + 8 + 5 = 29). - להוסיף 5 מיליליטר מראש ומחוממת RPE בינוני 15 מ"ל צינור חרוטי המכילות את התאים מעוכל. ספין-x 200 גרם עבור 5 דקות כדי לאסוף את התאים. מחדש להשעות ותאי זרע על 35 מ מ מצופה מראש מנות ב 10 – 20% confluency (למשל, 100% confluent על צלחת 12-ובכן חמש מנות 35 מ מ על 10% confluency).
הערה: בכל עת, להימנע pipetting נמרצת, אשר עלולה לגרום למות בתא משמעותיים כמו מיוצג על ידי פסולת תא כהה לכאורה תגובת שיקוע לאחר צנטריפוגה. זריעה תא בודד מופרדים היטב חיוני עבור הקלטת מלחציים תיקון. - לבצע את התיקון השלם-תא מלחציים כפי שתואר לעיל18,26,27,28,29,30,31. לרכוש עקבות הנוכחי ממשפחה של פוטנציאל שלב (-100 על +100 mV של פוטנציאל החזקה של 0 mV) (איור 5).
הערה: המתכונים של פתרונות חיצוניים ופנימיים מתוארים בטבלה 3 ו- 4 בטבלה, בהתאמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הצעד המאתגר ביותר מבחינה טכנית הוא הבידוד ידנית, שמטרתה להשיג טוהר גבוה של אוכלוסיה hPSC-RPE הבדיל P0 . לאחר בידוד מוצלח, > תאים 90% באוכלוסייה P0 לגדול ולהתבגר כדי להציג חתימה RPE מורפולוגיות (איור 1C). קיומו של חלק מינורי שאינו-RPE או תאי RPE ילדותי באוכלוסייה P0 הוא כמעט בלתי נמנע, אך לא יתערב הניסויים במורד הזרם כל עוד מספר התאים hPSC-RPE פיגמנט ואת בצורת המרוצף מציפות הרוב.
עם הגישה המחלה-ב--תבשיל hPSC-RPE מבוסס, מוטציה BEST1 כל מטופל ספציפי יכול להיות מאופיין באופן מקיף ויוו עבור ביטויה חלבון (immunoblotting, איור 3), (סחר ממברנה immunostaining, איור 4), יון ערוץ פונקציה (מלחציים תיקון כל תא, איור 5). תוצאות אלה יספקו מידע חיוני עבור שחקרתי את המנגנונים פתולוגי של מוטציות ערוץ, ולפיתוח רפואה אישית.
כפי BEST1 מתבטאת בעיקר תאי RPE, זה יכול לשמש כסמן הסלולר לשם האימות של מצב RPE בוגרת. יצוין, כי כמה מוטציות BEST1 עלול להשפיע על ביטויה חלבון, אז סמנים RPE ומבוססת אחרים כגון RPE65 ו- CRALBP עדיין צורך להיות מוערכים (איור 3).
התבגר P0 hPSC-RPE תאים יכול להישמר במשך 2-3 חודשים לפני פיצול (ל- P1) עבור תיקון כל-תא קלאמפ. P0 תאים שגילן עולה על 3 חודשים לא מומלצים עבור תיקון קלאמפ אך עדיין יכולים לשמש לניסויים immunoblotting ו- immunostaining.
איור 1: הבדיל תאים hPSC-RPE בשלבים שונים. להחליפן בתמונות של hPSC פיגמנט-RPE אשכולות בתוך תרבות צלחות על הופעתו הראשונה (A), לפני בידוד (B), ואחרי צמיחה לפדיון פוסט בידוד (C). ממעוף ותמונות 20 X שלב ניגודיות מוצגים לוחות עליונים ותחתונים, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: תמונת הנציגה המגרד תא מיקרו מהכלא פיפטה פסטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: אימות של מצב RPE בוגרת hPSC הבדיל-RPE תאים על-ידי immunoblotting. שהכלים מציג את הביטוי של סמני חלבונים ספציפיים RPE BEST1, RPE65 ו- CRALBP בתאים hPSC ו- hPSC-RPE WT. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: Immunostaining של BEST1 ב WT hPSC-RPEs. (א) תמונות immunofluorescent נציג מציג לוקליזציה ממברנה של WT BEST1 בתאים hPSC-RPE בצורת המרוצף. Immunostaining (B) שליליות שליטה תוך השמטת הנוגדן הראשי BEST1.
איור 5: תאים כל תיקון קלאמפ הקלטות של hPSC-RPEs. (א) A hPSC יחיד-RPE תא עבור תיקון כל-תא קלאמפ. עקבות הנוכחי נציג (B), הקליט BEST1 WT של hPSC-RPE ו BEST1 מוטציה hPSC-RPE במהירות שיא Ca2 +. פרוטוקול מתח שמשמש שמעודדים זרמי מוצג את תותב. סרגל קנה מידה = נה 1, 150 גב' ראה טבלאות 3 ו- 4 בטבלה עבור תיקון הצמד הפרטים הכנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| מגיב | כמות |
| DMEM הנוק-אאוט (KO) | 500 מ |
| קו חלופי סרום | 15% (75 מ) |
| חומצות אמינו שאינן חיוניות | 1% (5 מ"ל) |
| גלוטמין | 1% (5 מ"ל) |
| פניצילין-סטרפטומיצין | 1% (5 מ"ל) |
| Nicotinamide | 10 מ מ |
| Activin האנושי-A * | 100 ננוגרם למ"ל |
| * האדם activin-A הוא בתוספת בימים 15 – 28 של פרוטוקול בידול. | |
טבלה 1: RPE בידול בינוני.
| מגיב | כמות |
| מם (α שינוי) | 500 מ |
| סרום שור עוברית | 5% (25 מ) |
| תוספת N1 | 1% (5 מ"ל) |
| גלוטמין-פניצילין-סטרפטומיצין | 1% (5 מ"ל) |
| חומצות אמינו שאינן חיוניות | 1% (5 מ"ל) |
| טאורין | 125 מ ג |
| הידרוקורטיזון | 10 µg |
| Triiodo-thyronin | 0.0065 µg |
טבלה 2: RPE תרבות בינוני.
| מגיב | ריכוז |
| CsCl | 130 מ מ |
| MgCl2 | 1 מ מ |
| EGTA | 10 מ מ |
| מגנזיום ATP | 2 מ מ |
| HEPES (pH 7.4) | 10 מ מ |
| CaCl2* | משתנה |
| גלוקוז * * | ~ 5 מ מ |
| * להוסיף CaCl2 כדי להשיג את האישורים הרצויים2 + ריכוז | |
| * * שימוש גלוקוז כדי להתאים את osmolarity כדי 290 – 295 mOsm/L | |
טבלה 3: תיקון קלאמפ הפתרון הפנימי.
| מגיב | ריכוז |
| NaCl | 140 מ מ |
| אשלגן כלורי | 5 מ מ |
| MgCl2 | 1 מ מ |
| CaCl2 | 2 מ מ |
| HEPES (pH 7.4) | 10 מ מ |
| גלוקוז * | ~ 5 מ מ |
| להשתמש גלוקוז כדי להתאים את osmolarity כדי mOsm 300 – 305/ל' | |
טבלה 4: תיקון קלאמפ פתרון חיצוני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההליך החשוב ביותר עבור הגישה המחלה-ב--מאכל הוא להבדיל hPSCs עם מוטציה גורמי מחלות לשושלת התא הנכון, אשר RPE עבור BEST1. לפיכך, לאחר ניסוי בידול, התאים hPSC-RPE שנוצר בקפידה לאמת על מעמדם בוגר ספציפי RPE מורפולוגיות, חלבון סמני16,17,18. כדי למזער את החפץ המשובטים, מספר שיבוטים hiPSC מן המטופל אותו או שיבוטים hESC מרובים עם מוטציה זהה אמור לשמש במידת האפשר.
ניתן להבחין גם hiPSC וגם hESC קווים כדי RPE באותו הפרוטוקול. hiPSCs עם או בלי מוטציה בגן BEST1 שניתן לתכנת מ fibroblasts העור המטופלים BEST1 או תורמים בריא, בהתאמה. hESCs נושא מוטציה ב- BEST1 יכול להיות מהונדסים גנטית משורת hESC הורים, אשר יש את BEST1 (WT) פראי-סוג. המסלולים hiPSC-RPE ו- hESC-RPE יש יתרונות וחסרונות משלהם. הראשון הוא יותר למטופל הספציפי, קלינית הרלוונטי, במיוחד רפואה אישית. עם זאת, ראוי לציין כי ישנם מספר מגבלות הגישה hiPSC-RPE: 1) קשה לוגיסטית לגשת ספקטרום מלא של דגימות מטופלים BEST1 , כמו תמיד לא ניתן יהיה להעניק תרומות מחולים, כמה מוטציות הם מאוד נדיר במקום הראשון; 2) שאינם ספציפיים פנוטיפים העלולות לנבוע מרקע גנטי והתנאים הפיזיים של התורמים; 3) hiPSC RPE בידול ליעילות משתנה עבור תורמים שונים, כך במקרים מסוימים עשויה להיות מאתגרת מבחינה טכנית כדי לקבל hiPSC-RPEs. מצד שני, hESC-RPE ניתוב, למרות יותר מלאכותי, מציעה פלטפורמה תכליתי כדי ליצור isogenic hESC-RPEs עם מוטציות הרצוי לפי דרישה לחקירה פונקציונליים אפשר לקבל.
תאי RPE בוגרת הם פיגמנט, מצולע, מקושר באמצעות צמתי צר ב טפט. לאחר פיצול לתוך אוכלוסיה תא בודד עבור תיקון קלאמפ, התאים hPSC reseeded טרי-RPE לאבד את הצורה מצולע, אך עדיין שומרות על פיגמנטציה למשך מספר ימים (איור 5A). מלחציים תיקון הוא שבוצעו 24-72 h לאחר פיצול התא, אשר במהלכו הפיגמנטציה עדיין יכולים לשמש כסמן גלוי כדי לבחור את התאים עם מצב RPE טוב. תא עדין לפצל וכתוצאה מכך רוב של תאים בודדים מופרדים היטב ללא מוות תאים משמעותי הוא המפתח להצלחה של המלחציים תיקון.
מספר פרוטוקולים אחרים בידול באמצעות גורמי גדילה ומדיה תרבות של תאים שונים תועדו21,הספרות32. הזמן הדרוש הבידול של hPSC כדי RPE הוא דומה כל פרוטוקולים אלה כולל שלנו, אמנם זה קשה לדעת אם יש הבדל משמעותי יעילות בידול ללא השוואה side-by-side. יצוין כי בפרוטוקול הנוכחי, hPSC-RPE התאים גדלים לוחות שטוחים רגילים אך לא על צלחות עם ממברנה מוסיף, אז hPSC-RPE שנוצר באמצעות הליך זה לא עשוי בצורה הטובה ביותר לסכם הקוטביות של RPE תאים ויוו. לכן, מהטכניקות שתוארו לעיל מתאימים בעיקר ב הגדרת המחקר33, למרות התאים שנוצר hPSC-RPE יכול להיות גם תרבותי בתוך צלחות Transwell טופס טפט RPE גיליונות עבור מטרות קלינית17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
הפרויקט מומן על ידי מענקים NIH EY025290, GM127652, אוניברסיטת רוצ'סטר סטארט-אפ מימון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knock-Out (KO) DMEM | ThermoFisher | 10829018 | |
| KO serum replacement | ThermoFisher | 10829028 | |
| Nonessential amino acids | ThermoFisher | 11140050 | |
| Glutamine | ThermoFisher | 35050061 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Human activin-A | PeproTech | 120-14 | |
| MEM (a modification) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| N1 supplement | Sigma-Aldrich | N6530 | |
| Glutamine-penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | G1146 | |
| Nonessential amino acids | Sigma-Aldrich | M7156 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0386 | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T5516 | |
| mTeSR-1 medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| Trypsin | VWR | 45000-664 | |
| M-PER mammalian protein extraction reagent | Pierce | 78501 | |
| proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| RPE65 antibody | Novus Biologicals | NB100-355 | |
| CRALBP antibody | Abcam | ab15051 | |
| BEST1 antibody | Novus Biologicals | NB300-164 | |
| Beta Actin antibody | ThermoFisher | MA5-15739 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG | ThermoFisher | A-21202 | |
| Goat anti-mouse IgG | ThermoFisher | SA5-35521 | |
| Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-68071 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | 62249 | |
| HEKA EPC10 patch clamp amplifier | Warner Instruments | 895000 | |
| Patchmaster | Warner Instruments | 895040 |
References
- Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Hum Genet. 104 (6), 449-453 (1999).
- Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. Am J Hum Genet. 82 (1), 19-31 (2008).
- Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 85 (5), 581-592 (2009).
- Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. Eur J Hum Genet. 8 (4), 286-292 (2000).
- Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best's disease). Hum Mol Genet. 7 (9), 1517-1525 (1998).
- Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nat Genet. 19 (3), 241-247 (1998).
- Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (10), 3683-3689 (2004).
- Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Mol Ther. 23 (12), 1805-1809 (2015).
- Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Boon, C. J., et al. The spectrum of ocular phenotypes caused by mutations in the BEST1 gene. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 187-205 (2009).
- Marmorstein, A. D., Cross, H. E., Peachey, N. S. Functional roles of bestrophins in ocular epithelia. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 206-226 (2009).
- Fujii, S., Gallemore, R. P., Hughes, B. A., Steinberg, R. H. Direct evidence for a basolateral membrane Cl- conductance in toad retinal pigment epithelium. Am J Physiol. 262, C374-C383 (1992).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Effects of DIDS on the chick retinal pigment epithelium. II. Mechanism of the light peak and other responses originating at the basal membrane. J Neurosci. 9 (6), 1977-1984 (1989).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. J Neurophysiol. 70 (4), 1669-1680 (1993).
- Li, Y., Nguyen, H. V., Tsang, S. H. Skin Biopsy and Patient-Specific Stem Cell Lines. Methods Mol Biol. 1353, 77-88 (2016).
- Milenkovic, A., et al. Bestrophin 1 is indispensable for volume regulation in human retinal pigment epithelium cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2630-E2639 (2015).
- Moshfegh, Y., et al. BESTROPHIN1 mutations cause defective chloride conductance in patient stem cell-derived RPE. Hum Mol Genet. 25 (13), 2672-2680 (2016).
- Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1's essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. Elife. 6, (2017).
- Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). J Gen Physiol. 127 (5), 577-589 (2006).
- Volland, S., Esteve-Rudd, J., Hoo, J., Yee, C., Williams, D. S. A comparison of some organizational characteristics of the mouse central retina and the human macula. PLoS One. 10 (4), e0125631 (2015).
- Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
- Idelson, M., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells. Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).
- Mandai, M., et al. Autologous Induced Stem-Cell-Derived Retinal Cells for Macular Degeneration. N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
- Maruotti, J., et al. A simple and scalable process for the differentiation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 2 (5), 341-354 (2013).
- Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nat Commun. 4, 2540 (2013).
- Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), 18213-18218 (2014).
- Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346 (6207), 355-359 (2014).
- Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. PLoS One. 7 (5), e37079 (2012).
- Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T., Colecraft, H. M. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nat Chem Biol. 3 (12), 795-804 (2007).
- Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V., Colecraft, H. M. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. J Physiol. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).
- Gong, J., et al. Differentiation of Human Protein-Induced Pluripotent Stem Cells toward a Retinal Pigment Epithelial Cell Fate. PLoS One. 10 (11), e0143272 (2015).
- Zhang, Y., et al. ATP activates bestrophin ion channels through direct interaction. Nat Commun. 9 (1), 3126 (2018).
