Differenzierung, Wartung und Analyse der menschlichen Retina Pigment Epithelzellen: eine Krankheit im Gericht-Modell für BEST1 Mutationen
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll zur retinalen Pigmentepithels (RPE) Pigmentzellen aus menschlicher pluripotenter Stammzellen tragen Patienten abgeleitet Mutationen zu unterscheiden. Die mutierten Zelllinien können für Funktionsanalysen einschließlich Immunoblotting, Immunfluoreszenz und Patch-Clamp verwendet werden. Dieser Krankheit im Gericht Ansatz umgeht die Schwierigkeit, native menschlichen RPE-Zellen.
Abstract
Obwohl über 200 Genmutationen im menschlichen BEST1 gen identifiziert und mit degenerativen Netzhauterkrankungen verknüpft wurden, bleiben die pathologischen Mechanismen schwer vor allem aufgrund des Fehlens eines guten in Vivo -Modells für das Studium BEST1 und seine Mutationen unter physiologischen Bedingungen. BEST1 kodiert einen Ionenkanal, nämlich BESTROPHIN1 (BEST1), welche Funktionen im retinalen Pigmentepithel (RPE); jedoch ist der äußerst begrenzte Zugang zu nativen menschlichen RPE-Zellen eine große Herausforderung für die wissenschaftliche Forschung. Dieses Protokoll beschreibt die menschliche RPEs Lager BEST1 krankheitsauslösende Mutationen durch induzierte Differenzierung von menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs) zu generieren. Da hPSCs selbst erneuerbar sind, dieser Ansatz erlaubt es den Forschern, eine stete Quelle der hPSC RPEs für verschiedene experimentelle Analysen, z. B. Immunoblotting, Immunfluoreszenz und Patch-Clamp, zu haben und bietet somit ein sehr leistungsfähiges Krankheit im Gericht-Modell für BEST1-retinale Bedingungen verbunden. Insbesondere kann diese Strategie angewendet werden, um RPE (Patho) Physiologie und andere Gene von Interesse, die nativ in RPE zu studieren.
Introduction
Es ist dokumentiert worden, die mindestens fünf degenerative Netzhauterkrankungen durch genetische Mutationen im BEST1 gen1,2,3,4,5,6 entstehen , 7 , 8, mit der Anzahl der gemeldeten Mutationen bereits mehr als 200 und noch immer. Diese BEST1-assoziierten Krankheiten, auch bekannt als Bestrophinopathies, fortschreitenden Sehverlust und sogar Blindheit verursachen, und es gibt derzeit keine wirksamen Therapien. Die Protein-Produkt von BEST1, nämlich BESTROPHIN1 (BEST1), ist ein Ca2 +-aktivierte Cl– -Kanal (CaCC) speziell in das retinale Pigmentepithel (RPE) der Augen5,6, ausgedrückt 8,9. Wichtig ist, einen klinischen Phänotyp BEST1-Folgeerkrankungen ist die reduzierte visuelle Antwort auf lichtreize, namens light Peak (LP) gemessen in der Electrooculogram10,11; LP wird geglaubt, um durch ein CaCC RPE12,13,14vermittelt werden. Um die pathologischen Mechanismen der BEST1 Mutationen besser zu verstehen und darauf hinarbeiten, mögliche Therapien, unbedingt studieren mutierten BEST1 Kanäle endogen in menschlichen RPE-Zellen exprimiert.
Jedoch RPE Zellen direkt vom live-Patienten ist sehr unpraktisch. Obwohl native RPE-Zellen aus Biopsien von menschlichen Leichen und Föten geerntet werden können, schränkt der schwierige Zugang zu diesen Quellen deutlich wissenschaftlichen Forschung. Daher ist es wichtig, alternative RPE-Quellen als das menschliche Auge. Dieser Aufruf wurde durch die jüngsten Fortschritte in der Stammzellenforschung Techniken beantwortet wie funktionale RPE-Zellen können jetzt aus menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs), einschließlich der embryonalen Stammzellen (hESC) unterschieden und pluripotente Stammzellen (HiPSCs), letzteres induzierte durch Umprogrammierung primäre Haut Fibroblasten vom Geber16,17,18generiert wird. Wichtig ist, der Selbsterneuerung und Pluripotenz von hPSCs gewährleisten eine zuverlässige Quelle um RPEs, zu erzeugen, während die Patienten Spezifität der HiPSCs und genomic Änderung Potenzial embryonaler (z. B.durch CRISPR) bieten ein vielseitiges Krankheit-Gericht-Modell für gewünschte BEST1 Mutationen.
hPSC-RPE hat mehrere Vorteile gegenüber Mäusen RPE Modelle: 1) BEST1 -Knockout-Mäusen zeigen kein Netzhaut Anomalie19, Anhebung der Möglichkeit unterschiedliche genetische Anforderungen der BEST1 im RPE zwischen Mäusen und Menschen; (2) nur 3 % der menschlichen RPE-Zellen sind zweikernige, im Gegensatz zu 35 % in Mäusen20; (3) HiPSC-RPE potenziert autologe Transplantation in der klinischen Behandlung von retinalen Erkrankungen des21. Dennoch, Tiermodelle sind nach wie vor unverzichtbar für ein Studium RPE Physiologie und Pathologie in einem live-System und die Onkogene Potential des HiPSC nicht zu übersehen.
Hier wird beschrieben, eine nützliche und mäßig einfach hPSC RPE Differenzierung-Protokolls, die für Forschung und klinische Zwecke verwendet werden können. Dieses Protokoll verwendet Nicotinamid (Vitamin B3) Differenzierung des hPSCs, Nervengewebe, erweitern die weitere induziert wird, in RPE zu unterscheiden durch die Behandlung mit Activin-A. Nicotinamid Behandlung ist gezeigt worden, die Zahl der pigmentierten Zellen (ein Zeichen der Differenzierung in RPE), möglicherweise durch mildernde die Aktivität Apoptotic Zellen22zu unterscheiden. Die resultierenden hPSC RPE-Zellen anzeigen die gleiche wichtige Marker, Kopfsteinpflaster Morphologie und zelluläre Funktionen als native menschlichen RPE Zellen22. Somit eignen sich inmitten der Forschung, die resultierenden hPSC RPE-Zellen für nachgeschaltete Funktionsanalysen einschließlich Immunoblotting, Immunostaining und ganze Zelle Patch Clamp, für die detaillierte experimentelle Verfahren sind ebenfalls vorhanden. RPE Zellen aus Stammzellen haben klinisch, großes Potenzial für die Transplantation Behandlung der Makula-Degeneration in tierexperimentellen Studien und Studien am Menschen23gezeigt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das wichtigste Verfahren für die Krankheit im Gericht Ansatz soll hPSCs mit einer krankheitsverursachenden Mutation auf die richtige Zelle Abstammung zu unterscheiden, die RPE für BEST1ist. So sollte nach jeder Differenzierung Experiment die resultierenden hPSC RPE-Zellen sorgfältig für ihren Reifen Status von RPE-spezifische Morphologien und Protein-Marker16,17,18überprüft werden. Zur Minimierung von klonalen Art…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Projekt wurde von NIH-Stipendien EY025290, GM127652 und University of Rochester Anschubfinanzierung finanziert.
Materials
| Knock-Out (KO) DMEM | ThermoFisher | 10829018 | |
| KO serum replacement | ThermoFisher | 10829028 | |
| Nonessential amino acids | ThermoFisher | 11140050 | |
| Glutamine | ThermoFisher | 35050061 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Human activin-A | PeproTech | 120-14 | |
| MEM (a modification) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| N1 supplement | Sigma-Aldrich | N6530 | |
| Glutamine-penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | G1146 | |
| Nonessential amino acids | Sigma-Aldrich | M7156 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0386 | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T5516 | |
| mTeSR-1 medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| Trypsin | VWR | 45000-664 | |
| M-PER mammalian protein extraction reagent | Pierce | 78501 | |
| proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| RPE65 antibody | Novus Biologicals | NB100-355 | |
| CRALBP antibody | Abcam | ab15051 | |
| BEST1 antibody | Novus Biologicals | NB300-164 | |
| Beta Actin antibody | ThermoFisher | MA5-15739 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG | ThermoFisher | A-21202 | |
| Goat anti-mouse IgG | ThermoFisher | SA5-35521 | |
| Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-68071 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | 62249 | |
| HEKA EPC10 patch clamp amplifier | Warner Instruments | 895000 | |
| Patchmaster | Warner Instruments | 895040 |
References
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