Différenciation, l’entretien et l’analyse des cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien humain : un modèle de maladie-dans-un-plat pour les Mutations BEST1
Summary
Nous présentons ici un protocole afin de différencier les cellules (pre) de l’épithélium pigmentaire rétinien des cellules souches pluripotentes humaines portant le patient dérivé des mutations. Les lignées de cellules mutantes peuvent servir pour des analyses fonctionnelles dont immunoblotting, immunofluorescence et patch clamp de. Cette approche de la maladie-dans-un-plat contourne la difficulté d’obtenir des cellules humaines natifs de RPE.
Abstract
Bien que plus de 200 mutations génétiques du gène BEST1 humain ont été identifiées et liées aux maladies dégénératives de la rétine, les mécanismes pathologiques demeurent insaisissables principalement en raison de l’absence d’un modèle de bonne in vivo pour étudier BEST1 et ses mutations dans des conditions physiologiques. Best1 encode un canal ionique, à savoir BESTROPHIN1 (BEST1), qui fonctionne dans l’épithélium pigmentaire rétinien (RPE) ; Toutefois, l’accès extrêmement difficile pour les cellules humaines natifs de RPE constitue un défi majeur pour la recherche scientifique. Ce protocole décrit comment générer des RPE humaines portant des mutations pathogènes BEST1 de différenciation induite par les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs). Comme hPSCs sont des renouvelables, cette approche permet aux chercheurs d’avoir une source stable de RPE-hPSC pour diverses analyses expérimentales, comme immunoblotting, immunofluorescence et patch clamp de l’et fournit ainsi un modèle de maladie-dans-un-plat très puissant pour Best1-rétiniennes conditions associées. Notamment, cette stratégie peut être appliquée pour étudier la physiologie de la RPE (patho) et d’autres gènes d’intérêt exprimé en mode natif en pre.
Introduction
Il a été établi qu’au moins cinq maladies dégénératives rétiniennes sont causées par des mutations génétiques dans le BEST1 gène1,2,3,4,5,6 , 7 , 8, avec le nombre de mutations signalées déjà plus de 200 et toujours croissant. Ces BEST1-maladies associées, également connu sous le nom de bestrophinopathies, provoquent une perte progressive de la vision et même la cécité, et il n’y a actuellement aucun traitement efficace. Le produit protéique de BEST1, à savoir BESTROPHIN1 (BEST1), est un Ca2 +-canal Cl– activé (CaCC) spécifiquement exprimé dans l’épithélium pigmentaire rétinien (RPE) des yeux5,6, 8,9. Ce qui est important, un phénotype clinique de BEST1-maladies associées est la réponse visuelle réduite à des stimuli lumineux, appelé light peak (LP) mesurée dans l’electrooculogram10,11; LP est censé être médiée par un CaCC RPE12,13,14. Afin de mieux appréhender les mécanismes pathologiques des mutations BEST1 et de œuvrer en faveur des thérapies potentielles, il est essentiel d’étudier mutant BEST1 canaux exprimés dans les cellules humaines de RPE.
Cependant, les cellules directement à partir de patients vivants obtention RPE est très peu pratique. Bien que les cellules RPE natifs peuvent être récoltées de biopsies de cadavres humains et des foetus, l’accessibilité difficile à ces sources limite considérablement la recherche scientifique. Par conséquent, il est essentiel de disposer d’autres sources RPE autres que l’oeil humain. Cet appel a répondu par des avancées récentes dans les techniques de cellules souches, cellules fonctionnelles de RPE peuvent maintenant être différencier des cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs), y compris les cellules souches embryonnaires (CSEh) et induit des cellules souches pluripotentes (hiPSCs), ce dernier généré en reprogrammant les fibroblastes de l’épiderme primaire de donateurs16,17,18. Ce qui est important, l’auto-renouvellement et la pluripotence des hPSCs s’assurer une source fiable pour générer des RPE, tandis que la patient-spécificité de hiPSCs et potentiel de modification génomique des CSEh (p. ex., par CRISPR) proposent un modèle polyvalent de la maladie-dans-un-plat pour mutations BEST1 désirées.
hPSC-RPE a plusieurs avantages par rapport aux souris modèles RPE : 1) chez des souris knockout BEST1 ne s’affichent pas toute anomalie rétinienne19, évoquant la possibilité d’une condition génétique différente de BEST1 en pre entre les souris et les humains ; 2) seulement 3 % des cellules humaines de RPE sont binuclées, comparativement à 35 % en souris20; 3) hiPSC-RPE potentialise autogreffe en clinique des troubles de traitement de la rétine21. Néanmoins, les modèles animaux sont encore indispensables pour l’étude des RPE physiologie et pathologie dans un système live, et le potentiel oncogène de hiPSC ne peut être négligé.
La procédure ici décrit un hPSC utile et modérément simple protocole de différenciation RPE qui peut être utilisé pour la recherche et à des fins cliniques. Ce protocole utilise nicotinamide (vitamine B3) pour augmenter la différenciation des hPSCs de tissu neural, qui est davantage induit à se différencier en RPE par un traitement avec l’activine-A. Nicotinamide traitement s’est avéré augmenter le nombre de cellules pigmentées (signe de différenciation en RPE), éventuellement en atténuant l’activité apoptotique de différencier les cellules22. Les cellules qui en résulte de la hPSC-RPE affichent les mêmes marqueurs clés, la morphologie pavées et fonctionnalité cellulaire comme native humaine de cellules RPE22. Ainsi, dans un contexte de recherche, les cellules hPSC-RPE qui en résulte sont adaptés pour des analyses fonctionnelles en aval dont immunoblotting, immunocoloration et pince à germes entiers patch, pour lesquelles des procédures expérimentales détaillées sont également fournis. Cliniquement, les cellules RPE dérivés de cellules souches ont montré grand potentiel pour le traitement de la transplantation de la dégénérescence maculaire dans les études chez l’animal et essais humains23.
Protocol
Representative Results
Discussion
La procédure la plus importante à l’approche de la maladie-dans-un-plat est de différencier les hPSCs avec une mutation pathogène à la lignée cellulaire correcte qui est pre pour BEST1. Ainsi, après chaque expérience de différenciation, les cellules hPSC-RPE qui en résulte doivent être soigneusement validés pour leur statut mature de morphologies spécifiques RPE et protéines marqueurs16,17,18. Pour minim…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce projet a été financé par le NIH subventions EY025290, GM127652 et University of Rochester fonds de démarrage.
Materials
| Knock-Out (KO) DMEM | ThermoFisher | 10829018 | |
| KO serum replacement | ThermoFisher | 10829028 | |
| Nonessential amino acids | ThermoFisher | 11140050 | |
| Glutamine | ThermoFisher | 35050061 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Human activin-A | PeproTech | 120-14 | |
| MEM (a modification) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| N1 supplement | Sigma-Aldrich | N6530 | |
| Glutamine-penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | G1146 | |
| Nonessential amino acids | Sigma-Aldrich | M7156 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0386 | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T5516 | |
| mTeSR-1 medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| Trypsin | VWR | 45000-664 | |
| M-PER mammalian protein extraction reagent | Pierce | 78501 | |
| proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| RPE65 antibody | Novus Biologicals | NB100-355 | |
| CRALBP antibody | Abcam | ab15051 | |
| BEST1 antibody | Novus Biologicals | NB300-164 | |
| Beta Actin antibody | ThermoFisher | MA5-15739 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG | ThermoFisher | A-21202 | |
| Goat anti-mouse IgG | ThermoFisher | SA5-35521 | |
| Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-68071 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | 62249 | |
| HEKA EPC10 patch clamp amplifier | Warner Instruments | 895000 | |
| Patchmaster | Warner Instruments | 895040 |
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