Summary

Montagem e purificação do protótipo vírus espumoso Intasomes

Published: March 19, 2018
doi:

Summary

Integrase retroviral recombinante e oligómeros de DNA imitando extremidades de DNA virais podem formar um complexo enzimaticamente ativo conhecido como um intasome. Intasomes pode ser utilizado para estudos bioquímicos, estruturais e cinéticos. Este protocolo fornece detalhes sobre como montar e purificar o protótipo vírus espumoso intasomes.

Abstract

A definição de recurso e etapa necessária do ciclo de vida do retrovírus é a integração do genoma viral no genoma do hospedeiro. Todos os retrovírus codificam uma enzima integrase (IN) que cataliza a União covalente de viral para host de DNA, que é conhecido como transferência de vertente. Integração pode ser modelado em vitro com IN retroviral recombinante e oligómeros de DNA imitando as extremidades do genoma viral. Para recapitular mais de perto a reação de integração que ocorre na vivo, integração complexos são montados de recombinação IN e oligômeros sintéticos por diálise em um buffer de reduzida concentração de sal. A integração complexa, chamada um intasome, pode ser purificada por cromatografia de exclusão. No caso do vírus espumoso de protótipo (PFV), o intasome é um tetrâmero de IN e dois oligómeros de DNA e prontamente é separado do IN monomérico e livre oligómero de DNA. A eficiência de integração de intasomes PFV pode ser analisada sob uma variedade de condições experimentais para melhor compreender a dinâmica e mecânica de integração retroviral.

Introduction

Integração do genoma viral no genoma do hospedeiro é um passo obrigatório no ciclo de vida de todos os retrovírus1. A enzima viral integrase (IN) catalisa a União covalente de cada extremidade do genoma de DNA viral para o host de DNA. Durante uma infecção celular, faz parte de um complexo de pré-integração que medeia a integração. Recombinante em complexado com oligômeros de DNA encalhados dobro imitando as extremidades de DNA virais também pode realizar a integração em um DNA alvo em vitro2. Um comum integração ensaio em vitro utiliza um plasmídeo supercoiled como o DNA alvo. Integração de ambos os oligómeros de DNA virais (vDNA) para o plasmídeo resulta em um produto linear e é denominada integração concertada (Figura 2A). A integração do ensaio em vitro pode também produzir produtos com apenas um vDNA covalentemente unida com o plasmídeo de alvo, resultando em um círculo relaxado. Este produto de integração de meia-site parece ser um artefato de ensaio in vitro.

Recombinante em e vDNA podem realizar integração em vitro, mas eles não são reagentes ideais para o estudo da dinâmica ou estrutura de complexos de integração quando monomérico IN poderia obscurecer visualização relevante. Purificado de integração complexos, ou “intasomes”, são necessários estudos estruturais ou análise de dinâmica única molécula. PFV IN e vDNAs pode ser montado por diálise de um buffer de relativamente alta concentração de sal para uma baixa concentração de sal,3,4. Durante a diálise, um precipitate formulários. Esse precipitado é removido da diálise e a concentração de sal é aumentada. A maior concentração de sal solubiliza o precipitado contendo PFV intasomes. Os intasomes são então purificados por cromatografia de exclusão (SEC). IN de vírus espumoso (PFV) recombinante protótipo foi mostrado para existe como um monômero em solução em concentrações até 225 µM5. Fracionamento de SEC efetivamente separa o intasomes PFV (225.5 kDa), que inclui um tetrâmero de PFV IN e dois vDNAs, PFV monomérico em (44,4 kDa) e enciclopédia vDNA (24,0 kDa). O intasomes PFV pode ser congelado e manter a atividade de integração pelo menos seis meses de armazenamento a-80 ˚ c.

Recombinante PFV intasomes também pode ser modificado para incluir em substituições de aminoácidos ou mutações de truncamento ou vDNAs rotulado com fluorophores ou biotina4,6. Os purificado PFV intasomes executar prontamente integração em um alvo de plasmídeo supercoiled DNA em vitro. Ensaios de integração bioquímicos em massa com intasomes podem testar os efeitos de mutações, inibidores, ou outros aditivos químicos. Biotinilado intasomes pode ser usado para sondar a afinidade com os ácidos nucleicos e proteínas. PFV intasomes são funcionais à temperatura ambiente, permitindo a análise de microscopia única molécula por uma pinça magnética para medir o tempo entre juntar-se das duas extremidades vDNA ou fluorescência de reflexão interna total para visualizar a pesquisa de intasome no alvo DNA6. Além disso, PFV intasomes foram os primeiros a ser estruturalmente caracterizam afetar significativamente o campo de integração retroviral3.

Protocol

1. recozimento de vDNA Combinar 1 X 10 Buffer (estoque de 10 X 10: 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl, EDTA 10 mM), 10 µM 1 Oligo (5′ ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG 3′, 100 µM de estoque) e 10 µM 2 Oligo (5′ CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA 3′, 100 µM de estoque) em um volume final de 1,5 mL . Alíquota de 25 µ l para tubos de reação em cadeia (PCR) de 0,2 mL do polymerase sessenta.Nota: Dependendo da aplicação, oligómeros podem ser modificados com fluorophores ou tags 5′-na extremi…

Representative Results

PFV intasomes são montados de recombinação IN e vDNA. Após a montagem, intasomes são purificados pela SEC (Figura 1). Atividade de integração de cada fração é analisada com um supercoiled DNA alvo e agarose electroforese do gel (Figura 2). Este gel é fotografado com um scanner fluorescente definido para detectar EtBr (e fluoróforo, se rotulado de fluoróforo vDNA é usado). Volumes de pixel de banda usando o software …

Discussion

Retroviral INs formam uma complexo com DNA genômico viral para realizar a integração e continuar o ciclo de vida viral de multiméricas. O número de em monômeros por intasome pode ser tetrâmeros, octamers ou possivelmente maior ordem oriundas de11,12,13,14. PFV intasomes são um tetrâmero de recombinante com oligômeros de DNA dupla-hélice que imitam o DNA genômico viral termina<sup cl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pelo NIH AI099854 e AI126742 a chave.

Materials

DNA Oligomers IDT N/A Custom DNA Oligos
Tris Ultra Pure Gojira Fine Chemicals UTS1003
NaCl P212121 RP-S23020
UltraPure EDTA Invitrogen/Gibco 15575
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters Sigma-Aldrich Z677094-24EA 3 kDa MWCO
DTT  P212121 SV-DTT
BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) Sigma-Aldrich B6755-500G
ZnCl2 Sigma-Aldrich 208086
MgSO4 Amresco 0662
Glycerol  Thermo Fisher Scientific G37-20
Gel-loading tips, 1 – 200 μL Corning CLS4853-400EA
Razor blade; Single-edged; 100/Pk.; Pack of 100 Fisher Scientific 12-640
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL Thermo Fisher Scientific 568-0020
Dialysis tubing clips Spectrum Labs 132734
6-8 kDa 10 mm Dialysis Tubing Spectrum Medical 132645
Superose 6 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 17517201
Hi-Res Standard Agarose AGTC Bioproducts AG500D1
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302
Orange G Fisher Scientific 0-267
Hyladder 10kb, 500 lanes Denville Scientific CB4225-4

References

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Cite This Article
Mackler, R. M., Lopez Jr., M. A., Yoder, K. E. Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes. J. Vis. Exp. (133), e57453, doi:10.3791/57453 (2018).

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