アセンブリおよびプロトタイプ フォーミー ウイルス Intasomes の精製
Summary
組換えレトロ ウイルス ・ ウイルス DNA の両端を模倣した DNA オリゴマー、インタソームと呼ばれる酵素によって実行中の複合体を形成できます。Intasomes は、生化学、構造、および速度論的研究に使えます。このプロトコルは、組み立てるし、プロトタイプ フォーミー ウイルス intasomes を浄化する方法をについて説明します。
Abstract
A 宿主のゲノムにウイルスのゲノムの統合機能とレトロ ウイルスのライフ サイクルの必要なステップを定義することです。すべてのレトロ ウイルスは、ホスト DNA ストランド転送として知られているウイルスの共有結合を触媒するインテグラーゼ (IN) 酵素をエンコードします。統合では、組換えレトロ ウイルスの inの in vitroモデル化されるとウイルスのゲノムの端を模倣した DNA オリゴマーを可能性があります。密接に発生する生体内で、統合統合反応を要約するためには、削減塩濃度バッファーで透析による組換えと合成オリゴマーから錯体をまとめます。インタソームと呼ばれる、複雑な統合は、サイズ排除クロマトグラフィーによる精製があります。プロトタイプ フォーミー ウイルス (PFV) 場合、インタソームは 4 量体で、2 つの DNA オリゴマーと容易に単量体と無料オリゴマー DNA から分離されています。PFV intasomes の統合効率は、さまざまなダイナミクスを理解する実験条件やレトロ ウイルスの統合の仕組みの下で試金することがあります。
Introduction
宿主のゲノムにウイルスのゲノムの統合は、すべてのレトロ ウイルス1のライフ サイクルの必須のステップです。ウイルス酵素インテグラーゼ (IN は) ホスト DNA にウイルスのゲノム DNA の両端の共有結合に参加する触媒作用を及ぼします。細胞感染の間の統合を仲介事前統合複合体の一部です。組み換え体の二重鎖 DNA オリゴマー ウイルス DNA の両端を模倣した複合体2の in vitroターゲット DNA の統合を実行できます。一般的な統合アッセイの in vitro DNA ターゲットとしてスーパー プラスミドを利用します。プラスミッドを両方ウイルス DNA オリゴマー (vDNA) の統合は、リニア製品の結果し、協調統合 (図 2 a) と呼ばれています。統合分析、体外したリラックスしたサークルの結果ターゲット プラスミドに参加して 1 つだけ vDNA と製品をもたらすことがあります。この半サイト統合製品は、 in vitroアッセイのアーチファクトのように見えます。
組換えと vDNA を生体外の統合、実行可能性がありますが、単量体では関連する可視化に覆い隠さときはダイナミクスの研究や統合複合体の構造のための理想的な試薬。精製された統合の複合体、または「intasomes」が動的 1 分子解析または構造研究のため必要です。PFV のと vDNAs が組み立てられる透析によって比較的高い塩濃度バッファーから低い塩分濃度3,4。透析、沈殿物中のフォーム。この沈殿物が透析から削除され、塩濃度が増加します。高い塩濃度は可溶性沈殿物含む PFV intasomes です。サイズ排除クロマトグラフィー (SEC) では、intasomes は、精製します。組換えプロトタイプ フォーミー ウイルス (PFV) では最大 225 μ M5濃度でソリューションの単量体として存在する示されています。秒分別は効果的に (44.4 kDa) の単量体 PFV と無料 vDNA (24.0 kDa) から PFV のと 2 つの vDNAs の四量体が含まれています、PFV intasomes (225.5 kDa) を分離します。PFV intasomes は凍結する可能性があり、-80 ° C でのストレージの少なくとも 6 ヶ月間統合アクティビティを保持します。
組換え PFV intasomes は、アミノ酸置換、トランケーション変異またはフルオロまたはビオチン4,6の付いた vDNAs を含むように修正されるかもしれません。精製 PFV intasomes は容易に体外DNA プラスミドのスーパー ターゲットへの統合を実行します。Intasomes で一括生化学的統合アッセイは、阻害剤、または他の化学添加物の突然変異での効果をテストします。ビオチン化 intasomes は、核酸やタンパク質との親和性を調査する使用できます。PFV intasomes は、vDNA の両端またはターゲット上のインタソーム検索を視覚化する全反射蛍光の接合間の時間を測定する磁気ピンセットによる単一分子顕微鏡分析を可能周囲温度機能DNA6。また、PFV intasomes が最初に構造的に特徴付けられる大幅レトロ ウイルス統合3のフィールドに影響を与えます。
Protocol
Representative Results
Discussion
レトロ ウイルスをポリコームタンパク統合を実行し、ウイルスのライフ サイクルを続行するウイルスのゲノム DNA との複合体を形成します。テトラマー、octamers、または可能性が高いため多量11,12,13,14インタソームあたり単量体の数があります。PFV intasomes は、組換えウイルスのゲノム DNA を模し?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIH の AI099854 とキーに AI126742 によって支持されました。
Materials
| DNA Oligomers | IDT | N/A | Custom DNA Oligos |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | Sigma-Aldrich | Z677094-24EA | 3 kDa MWCO |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G37-20 | |
| Gel-loading tips, 1 – 200 μL | Corning | CLS4853-400EA | |
| Razor blade; Single-edged; 100/Pk.; Pack of 100 | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 568-0020 | |
| Dialysis tubing clips | Spectrum Labs | 132734 | |
| 6-8 kDa 10 mm Dialysis Tubing | Spectrum Medical | 132645 | |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517201 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Hyladder 10kb, 500 lanes | Denville Scientific | CB4225-4 |
References
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