JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
화학

Thioether/vinil sülfür-gergin helisel peptidler fotoğraf yolu ile indüklenen Thiol-KD/yne Hydrothiolation oluşturmak

Published: August 01, 2018
doi:
10.3791/57356
, , ,
1Key Laboratory of Chemical Genomics, School of Chemical Biology and Biotechnology,Peking University Shenzhen Graduate School

Summary

Helisel peptidler sülfür hayvan zinciri fotoğraf kaynaklı thiol-KD/thiol-yne hydrothiolation kullanarak thioether/vinil inşası için bir iletişim kuralı mevcut.

Abstract

Burada, intramolecular/cins thiol KD-Tarih-reçine hydrothiolation kullanarak thioether hayvan zinciri peptidler hazırlanması için detaylı bir protokol açıklayın. Ayrıca, bu iletişim kuralını intramolecular thiol yne-çözüm hydrothiolation alkene/alkin yan zincirleri sahip amino acids ve sistein kalıntıları arasında kullanarak ben, ben + 4 pozisyonlar vinil sülfür gergin peptidler hazırlanması açıklar. Doğrusal peptidler bir standart Fmoc tabanlı katı fazlı peptid sentez (SPP’ler) kullanarak sentez. Thiol-Güney hydrothiolation intramolecular thio-Doğu reaksiyon veya peptid uzunluğu bağlı olarak bir cins thio-Doğu reaksiyon kullanılarak yapılır. Bu araştırmada, intramolecular thio-Doğu reaksiyon reçine üzerinde deprotection sistein kalıntıları doğrusal peptid tam sentezi takip trityl grupları kullanarak daha kısa peptidler söz konusu olduğunda gerçekleşir. Reçine sonra photoinitiator 4-methoxyacetophenone (Harita) ve 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP) kullanarak UV ışınlama için ayarlanır. Cins thiol-Doğu tepki bir N, N– dimethylformamide (DMF) çözücü Fmoc-Cys-OH çözülerek yapılır. Bu o zaman alkene taşıyan kalıntı bağlı kullanarak peptid ile tepki. Bundan sonra macrolactamization harekete geçirmek reaktif reçine tarih olarak benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt) ve 4-Methylmorpholine (NMM) kullanarak yapılır. Peptid sentez macrolactamization devam standart SPP’ler kullanarak. Thio-yne hydrothiolation söz konusu olduğunda doğrusal peptid reçine–dan i ciddi, kurutulmuş ve daha sonra degassed DMF içinde çözünmüş. Bu o zaman UV ışığı photoinitiator 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone ile (DMPA) kullanarak ışınlanmış. Reaksiyon, DMF buharlaşmış ve ham kalıntı çöktürülmüş ve yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) kullanarak saf. Bu yöntemler thioether hayvan zinciri döngüsel peptidler üstün fonksiyonel grup hoşgörü ve iyi verim sahiptir thio-KD/yne tıklayın Kimya kullanımı nedeniyle nesil basitleştirmek için işlev olabilir. Thioether tahvil giriş peptidler içine sistein kalıntıları nükleofilik doğa yararlanır ve redoks-hareketsiz disülfür bağları göre.

Introduction

Protein-protein etkileşimleri (PPIs) modüle ligandlar geliştirmesi modern ilaç keşfi için çekici bir yaklaşım sağlar. Böylece, büyük bir çaba bu verimli PPIs1,2,3modüle Eğitim Roman kimyasal yöntemleri yatırdı. PPIs genellikle sığ, büyük ve/veya üretilmiyor etkileşen yüzeylerin oluşur ve küçük moleküller genelde PPIs4,5modülasyon için uygun olmayan ligandlar olarak kabul edilir. Bir uygun maruz etkileşen yüzey alanı ile bu sorun6,7gidermek için ideal aday protein arabirimleri yapısal özelliklerini taklit kısa peptidler temsil eder. Ancak, kısa peptidler genellikle sulu bir çözüm yapılandırılmamış. Gerçeğini peptid omurga ve iyi tanımlanmış biçimler oluşan intramolecular hidrojen bağı ağ ile rekabet su molekülleri su8‘ entropically olumsuz nedeni bu. Buna ek olarak, peptidler doğal olarak istikrar düşük ve hücre geçirgenlik özelliklerini büyük ölçüde onların biyolojik uygulamalar9,10sınırla. Protein veri Bankası (PDB) Analize göre > PPIs % 50’si kısa α-helix etkileşimleri11içerir. Böylece, farklı kimyasal yöntemler helix istikrar açısından geliştirdik. Bunlar arasında disülfit/thioether bağ oluşumu12,13,14, yüzük-kapanış sentezde15, laktam halkası oluşumu16, “Kimya17, eklenmesi tıklayın” perfluoroarenes18,19ve vinil-sülfür oluşumu20.

Stabilize helisel peptidler yaygın p53, dahil olmak üzere çeşitli hücre içi hedefleri için kullanılan östrojen reseptörleri, Ras, BCL-2 ailesi proteinler ve diğerleri21,22,23,24. ALRN-6924, bir all-hidrokarbon peptid çift inhibitörü olan MDM2 ve MDMX zımbalanmış, klinik araştırma25için kullanılıyor. Son birkaç yıl içinde bizim grup roman peptid sabitleme yöntemleri thiol-Doğu ve thiol yne reaksiyonlar26,27,28kullanarak geliştirme üzerinde odaklanmıştır. Genel olarak, doğal olarak bol miktarda sistein kullanıldığında bu fotoğraf tarafından başlatılan tepkiler hafif koşullar altında verimli göstermiştir. Buna ek olarak, biz bu tepkiler bir mükemmel fonksiyonel grup hoşgörü, biyo-dik ve peptid ve protein değişiklikler29için geçerli olduğu kanıtlanmış göstermiştir. Elde edilen thioether/vinil kaşif balonlu keşif sülfür peptidler büyük ölçüde kısıtlaması peptidler kimyasal alanı artırmak bir değişken urgan üzerinde değişiklik merkezi sağlamak ve çok sayıda biyolojik uygulamalar30 kullandığı için geçerli olduğu kanıtlanmıştır ,31,32. Bugüne kadar yalnızca sınırlı raporlar thiol-KD/thiol-yne peptid cyclization ile ilgili tarif edilmistir. Anseth ve ark. tarafından 2009 yılında yayınlanan bir çalışmada, bir reçine üzerinde intramolecular thiol-Doğu Sistein ile harekete geçirmek alkenes arasında peptid cyclization için gösterdiği33tepkiydi. 2015 yılında, Chou ve ark. bir iki radikal başlatılan thiol-Doğu tepki peptid34 ve bir sonraki, sıralı thiol-yne/Doğu kaplin tepki35Zımbalama için nitelendirdi. Son zamanlarda, bir dizi thioether/vinil kaşif balonlu keşif sülfür peptidler20,26,27tarihinde alan iş tanımladı. Bu iletişim kuralı yukarıda belirtilen thioether/vinil kaşif balonlu keşif sülfür peptidler daha geniş araştırma toplum için yararlı olacak umuduyla detaylı bir sentezi açıklar.

Protocol

1. ekipman hazırlık El ile peptid sentez cihazları için vakum manifold (Tablo reçetesi) bir verimli duman mahallede yerleştirin. Daha sonra Üçlü Kesme muslukları vakum manifold üzerine yerleştirin ve onları bir azot veya argon gaz hattı bağlayın. Kauçuk septa kullanarak tüm kullanılmayan girişleri kap. Reçine kaplı sütunları (0.8 x 4 cm, 10 mL rezervuar, bkz: Malzemeler tablo) üç yönlü Kesme muslukları (Şekil 1</stron…

Representative Results

HPLC ve MS spectra peptid Ac-YmS5AAAC-NH2 ve cyclized ürün Ac – Y-(siklo-1,5)-[mS5AAAC] – Tarih-reçine intramolecular thiol-Doğu photoreaction kullanarak oluşturulan NH2 figürü tasvir 6B. döngüsel peptid doğrusal onun öncü göre özdeş bir moleküler ağırlığa sahip bulundu. Ancak, onun HPLC tutma zamanı yaklaşık 2 dakika daha önce onun öncüleri aynı ayrımı koşullar altında daha olmak gö…

Discussion

Şekil 3‘ te açıklanan-reçine intramolecular thio-Doğu cyclization içinde sistein kalıntı trityl grup kaldırılması sonraki photoreaction için önemli bir adım olduğu anlaşıldı. Buna ek olarak, peptid molekül ağırlığı öncesinde ve sonrasında tepki olarak aynı olması için bulundu Şekil 6Btasvir. Bu nedenle, HPLC kimlik veya DTNB tahlil tepki izlemek için gereklidir. Şekil 4‘ te açıklanan cins thio-Doğu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar kabul mali desteği Çin hibe doğal Bilim Vakfı (No 21372023, 21778009 ve 81701818); Bakanlığı Bilim ve teknoloji-in Halk Cumhuriyeti Çin (No. 2015DFA31590); Shenzhen bilim ve teknoloji yenilik Komitesi (No. JCYJ20170412150719814, JCYJ20170412150609690, JCYJ20150403101146313, JCYJ20160301111338144, JCYJ20160331115853521, JSGG20160301095829250 ve GJHS20170310093122365); ve Çin doktora sonrası Bilim Vakfı (No. 2017 M 610704).

Materials

Rink Amide MBHA resin(0.53 mmol/g) HECHENG GRM50407
Standard Fmoc-protected amino acids GL Biochem (Shanghai) Ltd.
N-Methyl-2-pyrrolidinone Shenzhen endi Biotechnology Co.Ltd. 3230 skin harmful
N,N-Dimethyl formamide Energy B020051 skin harmful
Dichloromethane Energy W330229 skin harmful
N,N-Diisoproylethylamine Aldrich 9578 irritant
Trifluoroacetic acid J&K 101398 corrosive
Triisopropylsilane J&K 973821
1,2-Ethanedithiol J&K 248897 Stench
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate  GL Biochem (Shanghai) Ltd. 851012
Morpholine Aldrich M109062 irritant
Diethyl ether Aldrich 673811 flammable
Acetonitrile Aldrich 9758 toxicity
Methanol Aldrich 9758 toxicity
2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone Energy A050035
4-methoxyacetophenone Energy A050098
2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone Energy D070132
5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) J&K 281281
Benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate Energy E020172
1-Hydroxybenzotriazole Energy D050256
4-Methylmorpholine Energy W320038
High Performance Liquid Chromatography SHIMADZU LC-30AD
Electrospray Ionization Mass SHIMADZU LCMS-8030
Lyophilizer Labconco FreeZone
SpeedVac concentration system Thermo Savant
vacuum manifold promega A7231
three-way stopcocks Bio-Rad 7328107
poly-prep chromatography columns  Bio-Rad 7311550
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelay-Gimeno, M., Glas, A., Koch, O., Grossmann, T. N. Structure-based design of inhibitors of protein-protein interactions: mimicking peptide binding epitopes. Angewandte Chemie International Edition. 54 (31), 8896-8927 (2015).
  2. Passioura, T., Katoh, T., Goto, Y., Suga, H. Selection-based discovery of druglike macrocyclic peptides. Annual Review of Biochemistry. 83, 727-752 (2014).
  3. Gonzalez, M. W., Kann, M. G. Protein interactions and disease. PLoS Computational Biology. 8 (12), 1-11 (2012).
  4. Wilson, A. J. Inhibition of protein-protein interactions using designed molecules. Chemical Society Reviews. 38 (12), 3289-3300 (2009).
  5. Teresa, A. F. C., Alessio, C. Cyclic and macrocyclic peptides as chemical tools to recognise protein surfaces and probe protein-protein interactions. ChemMedChem. 11 (8), 787-794 (2016).
  6. Craik, D. J., Fairlie, D. P., Liras, S., Price, D. The future of peptide-based drugs. Chemical Biology & Drug Design. 81 (1), 136-147 (2013).
  7. Cromm, P. M., Spiegel, J., Grossmann, T. N. Hydrocarbon stapled peptides as modulators of biological function. ACS Chemical Biology. 10 (6), 1362-1375 (2015).
  8. Zhang, Q. Z., Tian, Y., Lao, Y. Z., Li, Z. G. Peptides-staple method development and its application in cancer therapy. Current Medicinal Chemistry. 21 (21), 2438-2452 (2014).
  9. Cromm, P. M., Spiegel, J., Grossmann, T. N. Hydrocarbon stapled peptides as modulators of biological function. ACS Chemical Biology. 10 (6), 1362-1375 (2015).
  10. Wang, D., Liao, W., Arora, P. S. Enhanced metabolic stability and protein-binding properties of artificial alpha helices derived from a hydrogen-bond surrogate: application to Bcl-xL. Angewandte Chemie International Edition. 44 (40), 6525-6529 (2005).
  11. Bullock, B. N., Jochim, A. L., Arora, P. S. Assessing helical protein interfaces for inhibitor design. Journal of the American Chemical Society. 133, 14220-14223 (2011).
  12. Jackson, D. Y., King, D. S., Chmielewski, J., Singh, S., Schultz, P. G. General approach to the synthesis of short α-helical peptides. Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9391-9392 (1991).
  13. Timmerman, P., Beld, J., Puijk, W. C., Meloen, R. H. Rapid and quantitative cyclization of multiple peptide loops onto synthetic scaffolds for structural mimicry of protein surfaces. ChemBioChem. 6 (5), 821-824 (2005).
  14. Muppidi, A., Wang, Z., Li, X., Chen, J., Lin, Q. Achieving cell penetration with distance-matching cysteine cross-linkers: a facile route to cell-permeable peptide dual inhibitors of Mdm2/Mdmx. Chemical Communications. 47 (33), 9396-9398 (2011).
  15. Schafmeister, C. E., Po, J., Verdine, G. L. An all-hydrocarbon cross-linking system for enhancing the helicity and metabolic stability of peptides. Journal of the American Chemical Society. 122 (24), 5891-5892 (2000).
  16. Osapay, G., Taylor, J. W. Multicyclic polypeptide model compounds. 1. synthesis of a tricyclic amphiphilic alpha-helical peptide using an oxime resin, segment-condensation approach. Journal of the American Chemical Society. 112 (16), 6046-6051 (1990).
  17. Lau, Y. H., Andrade, d. P., Wu, Y., Spring, D. R. Peptide stapling techniques based on different macrocyclisation chemistries. Chemical Society Reviews. 44 (1), 91-102 (2015).
  18. Spokoyny, A. M., Zou, Y., Ling, J. J., Yu, H., Lin, Y. S., Pentelute, B. L. A perfluoroaryl-cysteine S(N)Ar chemistry approach to unprotected peptide stapling. Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 5946-5949 (2013).
  19. Lautrette, G., Touti, F., Lee, H. G., Dai, P., Pentelute, B. L. Nitrogen arylation for macrocyclization of unprotected peptides. Journal of the American Chemical Society. 138 (27), 8340-8343 (2016).
  20. Tian, Y., et al. Stapling of unprotected helical peptides via photoinduced intramolecular thiol-yne hydrothiolation. Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).
  21. Chang, Y. S., et al. Stapled α-helical peptide drug development: a potent dual inhibitor of MDM2 and MDMX for p53-dependent cancer therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (36), 3445-3454 (2013).
  22. Zhao, H., et al. Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates. Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).
  23. Leshchiner, E. S., et al. Direct inhibition of oncogenic KRAS by hydrocarbon-stapled SOS1 helices. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1761-1766 (2015).
  24. Wang, D., Qin, X., Zhao, H., Li, Z. N-cap helix nucleation: methods and their applications. Science China Chemistry. 60 (6), 689-700 (2017).
  25. Zorzi, A., Deyle, K., Heinis, C. Cyclic peptide therapeutics: past, present and future. Current Opinion in Chemical Biology. 38, 24-29 (2017).
  26. Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
  27. Lin, H., Jiang, Y., Zhang, Q., Hu, K., Li, Z. An in-tether sulfilimine chiral center induces helicity in short peptides. Chemical Communications. 52 (68), 10389-10391 (2016).
  28. Zhao, B., Zhang, Q., Li, Z. Constructing thioether-tethered cyclic peptides via on-resin intra-molecular thiol-ene reaction. Journal of Peptide Science. 22 (8), 540-544 (2016).
  29. Dondoni, A., Massi, A., Nanni, P., Roda, A. A new ligation strategy for peptide and protein glycosylation: photoinduced thiol-ene coupling. 화학. 15 (43), 11444-11449 (2009).
  30. Hu, K., Sun, C., Li, Z. Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).
  31. Shi, X., Jiang, Y., Yang, D., Zhao, H., Tian, Y., Li, Z. Reversibly switching the conformation of short peptide through in-tether chiral sulfonium auxiliary. Chinese Chemical Letters. , (2017).
  32. Jiang, Y., et al. Switching substitution groups on the in-tether chiral centre influences backbone peptides’ permeability and target binding affinity. Organic & Biomolecular Chemistry. 15 (3), 541-544 (2017).
  33. Aimetti, A. A., Shoemaker, R. K., Lin, C. C., Anseth, K. S. On-resin peptide macrocyclization using thiol-ene click chemistry. Chemical Communications. 46 (23), 4061-4063 (2010).
  34. Wang, Y. X., Chou, D. H. C. A thiol-ene coupling approach to native peptide stapling and macrocyclization. Angewandte Chemie International Edition. 54 (37), 10931-10934 (2015).
  35. Wang, Y., et al. Application of thiol-yne/thiol-ene reactions for peptide and protein macrocyclizations. 화학. 23 (29), 7087-7092 (2017).
  36. Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. Solid-phase synthesis of short α-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach. Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).
  37. Ozyurek, M., Baki, S., Gungor, N., Celik, S. E., Guclu, K., Apak, R. Determination of biothiols by a novel on-line HPLC-DTNB assay with post-column detection. Analytica Chimica Acta. 750, 173-181 (2012).
  38. Zhang, Q. Z., et al. Chiral sulfoxide-induced single turn peptide α-helicity. Scientific Reports. 6, 38573 (2016).
  39. Lin, H., et al. An in-tether sulfilimine chiral center induces beta-turn conformation in short peptides. Organic & Biomolecular Chemistry. 14 (42), 9993-9999 (2016).
  40. Hu, K., Li, W., Yu, M., Sun, C., Li, Z. Investigation of cellular uptakes of the in-tether chiral-center-induced helical pentapeptides. Bioconjugate Chemistry. 27 (12), 2824-2827 (2016).
  41. Hu, K., et al. A precisely positioned chiral center in an i, i + 7 tether modulates the helicity of the backbone peptide. Chemical Communications. 53 (50), 6728-6731 (2017).
  42. Li, J., et al. An in-tether chiral center modulates the proapoptotic activity of the KLA peptide. Chemical Communications. 53 (75), 10452-10455 (2017).
  43. Zhao, B., et al. A thioether-stabilized-D-proline-L-proline-induced β-hairpin peptide of defensin segment increases its anti-Candida albicans ability. ChemBioChem. 17 (15), 1416-1420 (2016).
  44. Tian, Y., Yang, D., Ye, X., Li, Z. Thioether-derived macrocycle for peptide secondary structure fixation. The Chemical Record. 17 (9), 874-885 (2017).
  45. Hu, K., Yin, F., Yu, M., Sun, C., Li, J., Liang, Y., Li, W., Xie, M., Lao, Y., Liang, W., Li, Z. G. In-tether chiral center induced helical peptide modulators target p53-MDM2/MDMX and inhibit tumor growth in stem-like cancer cell. Theranostics. 7 (18), 4566-4576 (2017).
  46. Tian, Y., Jiang, Y., Li, J., Wang, D., Zhao, H., Li, Z. Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled α-helical peptides: a comparative study. ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).

Tags

ThioetherVinyl SulfideHelical PeptidesPhoto-induced Thiol-ene/yne Hydro-thiolationRink Amide MBHA ResinFmoc DeprotectionHCTUDIPEATrityl DeprotectionSolid-phase Peptide Synthesis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Shi, X., Liu, Y., Zhao, R., Li, Z. Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation. J. Vis. Exp. (138), e57356, doi:10.3791/57356 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image