نقدم على بروتوكول لبناء ثيويثير/الفينيل الببتيدات حلزونية المربوطة كبريتيد استخدام المستحثة بصور هيدروثيولاتيون ثيول-شرق/ثيول-ين.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصلة لإعداد الببتيدات المربوطة ثيويثير باستخدام هيدروثيولاتيون على راتنج إينتراموليكولار/الجزيئات ثيول-شرق. وبالإضافة إلى ذلك، يصف هذا البروتوكول إعداد الببتيدات الفينيل-كبريتيد المربوطة باستخدام هيدروثيولاتيون في حل إينتراموليكولار ثيول-ين بين amino acids التي تمتلك سلاسل الجانب الكين/ألكاين وبقايا السيستين في الأول، وأنا + 4 وظائف. تم توليفها الببتيدات الخطي باستخدام توليفة ببتيد المرحلة الصلبة قياسية المستندة إلى معتدلاً (الكائنة). ويضطلع ثيول-شرق هيدروثيولاتيون استخدام فعل شرق الايثير إينتراموليكولار أو فعل شرق الايثير الجزيئات، اعتماداً على طول الببتيد. في هذا البحث، يتم فعل شرق الايثير إينتراموليكولار في حالة الببتيدات أقصر باستخدام deprotection على راتنج المجموعات ترتيل سيستين المخلفات بعد إكمال تركيب الببتيد الخطي. ثم يتم تعيين الراتنج لإشعاع الأشعة فوق البنفسجية باستخدام فوتوينيتياتور 4-ميثوكسياسيتوفينوني (خريطة) و 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). يجري تفاعل الجزيئات ثيول-شرق بتذويب معتدلاً-Cys-OH في مذيب-dimethylformamide (DMF) ن، ن. هذا هو رد فعل ثم مع الببتيد باستخدام بقايا الكين الحاملة على راتنج. بعد ذلك، ماكرولاكتاميزيشن يجري استخدام سداسي فلوروفوسفات بينزوتريازولي-1-يل-أوكسيتريبيروليدينوفوسفونيوم (بيبوب) و 1-هيدروكسيبينزوتريازولي (هوبت) 4-ميثيلمورفوليني (نم) الكواشف التنشيط في الراتنج. بعد ماكرولاكتاميزيشن، هو استمرار التوليف الببتيد استخدام الكائنة القياسية. في حالة هيدروثيوليشن ين الايثير، المشقوق من الراتنج الببتيد الخطي، والمجففة، وحلت في وقت لاحق في يطرد DMF. وهذا هو المشع ثم استخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية مع فوتوينيتياتور 2، 2-ديميثوكسي-2-فينيلاسيتوفينوني (DMPA). وفي أعقاب رد الفعل، يتبخر DMF وبقايا النفط الخام هو عجل وتنقيته باستخدام كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك]). يمكن أن تعمل هذه الأساليب تبسيط جيل الببتيدات دوري المربوطة ثيوثير بسبب استخدام الكيمياء انقر الايثير-شرق/ين أنه يمتلك مجموعة وظيفية متفوقة التسامح ومحصول جيد. إدخال سندات ثيوثير في الببتيدات يستفيد من طبيعة تفاعلات من بقايا السيستين وهو الأكسدة خاملة بالنسبة للسندات ثنائي كبريتيد.
تطوير يغاندس تعدل تفاعلات البروتين البروتين (القياسية) يوفر نهج جذابة لاكتشاف الأدوية الحديثة. وهكذا، قد استثمر قدرا كبيرا من الجهد في دراسة الطرائق الكيميائية الرواية التي يمكن أن تعدل كفاءة القياسية1،،من23. القياسية تتألف عموما من السطوح المتفاعلة ضحلة كبيرة و/أو توقف، والجزيئات الصغيرة تعتبر عادة أن يغاندس غير مناسب لتحوير القياسية4،5. مع منطقة مكشوفة متفاعلة سطحية مناسبة، تمثل الببتيدات القصيرة التي تحاكي السمات الهيكلية لواجهات البروتين المرشحين المثالي لمعالجة هذه المشكلة6،7. بيد أن الببتيدات قصيرة عادة غير منظم في محلول مائي. وهذا يرجع إلى أن جزيئات الماء التي تتنافس مع شبكة الربط إينتراموليكولار الهيدروجين الببتيد العمود الفقري والمعالم والتشكلات غير مواتية انتروبيكالي في الماء8. وباﻹضافة إلى ذلك، الببتيدات المنخفضة أصلاً الاستقرار وخصائص نفاذية الخلية إلى حد كبير الحد من استخدامها في التطبيقات البيولوجية9،10. ووفقا لتحليل البيانات المصرفية (PDB) البروتين، > 50% القياسية تشمل قصيرة α-الحلزون التفاعلات11. وهكذا، تم وضع الطرق الكيميائية المختلفة فيما يتعلق باستقرار اللولب. هذه تشمل ثنائي كبريتيد/ثيوثير بوند تشكيل12،،من1314، إغلاق الطوق الناتج15، وتشكيل عصابة لاكتام16، “انقر فوق” الكيمياء17، إضافة بيرفلوروارينيس18،19، وكبريتيد ثنائي الفينيل تشكيل20.
استقرت الببتيدات حلزونية وتستخدم على نطاق واسع لمختلف الأهداف داخل الخلايا، بما في ذلك p53، الإستروجين مستقبلات، رأس، BCL-2 الأسرة البروتينات، والبعض الآخر21،22،،من2324. الرن-6924، جميع هيدروكربونية تدبيس الببتيد المانع المزدوج MDM2 ومدمكس، ويستخدم حاليا للتحقيق السريرية25. في السنوات القليلة الماضية، ركزت مجموعتنا على تطوير أساليب تحقيق الاستقرار الببتيد رواية استخدام ثيول-شرق وين ثيول ردود الفعل26،،من2728. وبصفة عامة، لقد أظهرنا أن ردود الفعل هذه الصورة بدأت كفاءة تحت ظروف معتدلة عندما يستخدم بطبيعة الحال سيستين وفيرة. وباﻹضافة إلى ذلك، وقد أظهرنا أن ردود الفعل هذه قد التسامح مجموعة وظيفية ممتازة، متعامد الحيوية، وقد ثبت أن تكون قابلة للتطبيق ل التعديلات الببتيد والبروتين29. ثيوثير/الفينيل كبريتيد المربوطة الببتيدات الناتجة إلى حد كبير تحسين الفضاء الكيميائية من الببتيدات القيد وتوفير مركز مجا على حبل تعديل، وثبت لتكون قابلة للتطبيق للاستخدام في التطبيقات البيولوجية العديدة30 ،،من3132. حتى الآن، وقد وصف التقارير محدودة فقط بخصوص سيكليزيشن الببتيد ثيول-شرق/ثيول-ين. في دراسة نشرتها أنسيته et al. في عام 2009، كان رد فعل على راتنج إينتراموليكولار ثيول-شرق الببتيد سيكليزاتيون بين الالكينات المنشط مع سيستين أظهرت33. في عام 2015، تشو وآخرون. ووصف رد فعل اثنين-عنصر جذري بدأ ثيول-شرق الببتيد التدبيس34 و رد اقتران ثيول-ين/شرق اللاحقة، متسلسلة35. في الآونة الأخيرة، وصفت لنا سلسلة من العمل القائم على ثيويثير/الفينيل كبريتيد المربوطة الببتيدات20،،من2627. ويصف هذا البروتوكول توليفة مفصلة من الببتيدات المذكورة أعلاه ثيويثير/الفينيل كبريتيد المربوطة بالأمل في أنه سيكون من المفيد للمجتمع البحث الأوسع نطاقا.
في سيكليزاتيون على راتنج إينتراموليكولار الايثير-شرق المبينة في الشكل 3، تم العثور على إزالة مجموعة تريتيل من بقايا السيستين أن تكون خطوة حاسمة بالنسبة فوتوريكتيون اللاحقة. وباﻹضافة إلى ذلك، الوزن الجزيئي الببتيد قبل وبعد تم العثور على رد فعل تكون متطابقة كما صورت في <stron…
The authors have nothing to disclose.
الكتاب الاعتراف بدعم مالي من “مؤسسة العلوم الطبيعية لمنح الصين” (رقم 21372023، 21778009 و 81701818)؛ وزارة العلوم والتكنولوجيا في الجمهورية الشعبية للصين (رقم 2015DFA31590)؛ شنتشن لجنة العلم والتكنولوجيا الابتكار (رقم JCYJ20170412150719814، JCYJ20170412150609690، JCYJ20150403101146313، JCYJ20160301111338144، JCYJ20160331115853521، JSGG20160301095829250، و GJHS20170310093122365)؛ ومؤسسة الصين لعلوم ما بعد الدكتوراه (رقم 2017 م 610704).
Rink Amide MBHA resin(0.53 mmol/g) | HECHENG | GRM50407 | |
Standard Fmoc-protected amino acids | GL Biochem (Shanghai) Ltd. | ||
N-Methyl-2-pyrrolidinone | Shenzhen endi Biotechnology Co.Ltd. | 3230 | skin harmful |
N,N-Dimethyl formamide | Energy | B020051 | skin harmful |
Dichloromethane | Energy | W330229 | skin harmful |
N,N-Diisoproylethylamine | Aldrich | 9578 | irritant |
Trifluoroacetic acid | J&K | 101398 | corrosive |
Triisopropylsilane | J&K | 973821 | |
1,2-Ethanedithiol | J&K | 248897 | Stench |
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate | GL Biochem (Shanghai) Ltd. | 851012 | |
Morpholine | Aldrich | M109062 | irritant |
Diethyl ether | Aldrich | 673811 | flammable |
Acetonitrile | Aldrich | 9758 | toxicity |
Methanol | Aldrich | 9758 | toxicity |
2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone | Energy | A050035 | |
4-methoxyacetophenone | Energy | A050098 | |
2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone | Energy | D070132 | |
5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) | J&K | 281281 | |
Benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate | Energy | E020172 | |
1-Hydroxybenzotriazole | Energy | D050256 | |
4-Methylmorpholine | Energy | W320038 | |
High Performance Liquid Chromatography | SHIMADZU | LC-30AD | |
Electrospray Ionization Mass | SHIMADZU | LCMS-8030 | |
Lyophilizer | Labconco | FreeZone | |
SpeedVac concentration system | Thermo | Savant | |
vacuum manifold | promega | A7231 | |
three-way stopcocks | Bio-Rad | 7328107 | |
poly-prep chromatography columns | Bio-Rad | 7311550 |