Presentamos un protocolo para la construcción de vinilo thioether sulfuro atado helicoidales péptidos mediante foto-inducida tiol-ene/tiol-Ino hydrothiolation.
Aquí, describimos un protocolo detallado para la preparación de péptidos thioether atado con hydrothiolation en resina intramolecular/intermoleculares tiol-ene. Además, este protocolo describe la preparación de péptidos vinilo-sulfuro-atado con hydrothiolation en solución tiol-Ino intramolecular entre residuos de cisteína y producto que poseen cadenas laterales de alkene/alquino en i, i + 4 posiciones. Péptidos lineales fueron sintetizados usando una síntesis de péptidos de fase sólida basado en el Fmoc estándar (SPPS). Tiol-ene hydrothiolation se lleva a cabo mediante una reacción intramolecular de thio-ene o una reacción intermolecular thio-ene, dependiendo de la longitud del péptido. En esta investigación se lleva a cabo una reacción intramolecular de thio-ene en el caso de péptidos más cortos utilizando en resina de desprotección de los grupos del trityl de después de la completa síntesis del péptido lineal de residuos de cisteína. La resina entonces se fija a la irradiación UV con fotoiniciador 4-methoxyacetophenone (mapa) y 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). La reacción intermolecular tiol-ene se lleva a cabo por Fmoc-Cys-OH se disuelve en un solvente de N, N– dimetilformamida (DMF). Esto es entonces reaccionó con el péptido utilizando el residuo de alkene-rodamiento en la resina. Después de eso, la macrolactamization se lleva a cabo utilizando hexafluorofosfato de benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (TOHB) y 4-Methylmorpholine (NMM) como reactivos de activación en la resina. Después de la macrolactamization, se continúa la síntesis de péptidos mediante SPPS estándar. En el caso de la hydrothiolation de thio-Ino, el péptido lineal es hendido de la resina, secado y posteriormente se disuelve en DMF desgasificada. Esto entonces se irradia con luz UV de fotoiniciador 2,2-dimetoxi-2-Fenilacetofenona (DMPA). Después de la reacción, DMF se evapora y el residuo crudo se precipita y purificado utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Estos métodos podrían funcionar para simplificar la generación de péptidos cíclicos thioether atado debido al uso de la química click thio-eno/Ino que posee grupo funcional superior tolerancia y buen rendimiento. La introducción de bonos thioether péptidos aprovecha la naturaleza nucleofílica de residuos de cisteína y es redox inertes con respecto a enlaces de disulfuro.
El desarrollo de ligandos para modular las interacciones proteína-proteína (IBP) proporciona un enfoque atractivo para el descubrimiento de medicamentos modernos. Así, se ha invertido mucho esfuerzo en estudiar modalidades química novedosas que eficientemente podrían modular los IBP1,2,3. Protones generalmente consisten en superficies de interacción superficiales, grandes o descontinuadas, y pequeñas moléculas típicamente se consideran ligandos inadecuados para la modulación de los IBP4,5. Con una conveniente expuesta interacción superficie, péptidos cortos que mímico las características estructurales de las interfaces de proteínas representan los candidatos ideales para abordar este problema6,7. Sin embargo, los péptidos cortos son típicamente no estructurados en una solución acuosa. Esto es debido a que las moléculas de agua que compiten con la red de enlace de hidrógeno intramolecular del esqueleto peptídico y conformaciones bien definidas son entropically desfavorables en agua8. Además, los péptidos inherentemente baja estabilidad y propiedades de permeabilidad de la célula en gran medida limitan su uso en aplicaciones biológicas9,10. Según el análisis del Banco de datos (PDB) de proteínas, > 50% de los IBP implican interacciones de α-hélice corta11. Así, se han desarrollado diferentes métodos químicos con respecto a la estabilización de la hélice. Éstos incluyen disulfuro/thioether enlace formación12,13,14, ring-closing metathesis15, anillo de lactama formación16, “haga clic en” química17, además de perfluoroarenes18,19y de la formación de sulfuro de vinilo20.
Estabilizado los péptidos helicoidales se utilizan ampliamente para diversos objetivos intracelulares, como p53, estrógeno receptores, Ras, BCL-2 familia las proteínas y otros21,22,23,24. ALRN-6924, un hidrocarburo de todo grapado inhibidor dual de péptido de MDM2 y MDMX, está siendo usado para investigación clínica25. En los últimos años, nuestro grupo se ha centrado en el desarrollo de métodos de estabilización de novedoso péptido con tiol-ene y tiol-Ino reacciones26,27,28. En general, hemos demostrado que estas reacciones iniciadas por foto son eficientes condiciones suaves cuando naturalmente se utiliza abundante cisteína. Además, hemos demostrado que estas reacciones tienen una tolerancia excelente grupo funcional, son bio-orthogonal y ha demostrado para ser aplicable para péptidos y proteínas modificaciones29. Los péptidos resultantes de sulfuro atado thioether vinilo en gran medida mejoran el espacio químico de péptidos de restricción, ofrecen un centro de modificación en tether lábil y ha demostrado para ser aplicable para su uso en numerosas aplicaciones biológicas30 ,31,32. Hasta la fecha, se han descrito solamente limitados informes sobre la ciclación de péptidos tiol-ene/tiol-Ino. En un estudio publicado por Anseth et al. , en 2009, una reacción en resina intramolecular tiol-ene para la ciclación de péptidos entre alquenos activados con cisteína fue demostrado33. En el año 2015, Chou et al. se describe una reacción de dos componentes iniciado radical tiol-ene para péptido grapado34 y una reacción de acoplamiento de eno-Ino/tiol posterior, secuencial35. Recientemente, hemos descrito una serie de trabajos basados en vinilo thioether sulfuro atado péptidos20,26,27. Este protocolo describe una detallada síntesis de los péptidos de sulfuro atado de vinilo thioether mencionados en la esperanza de que sea útil para la comunidad de investigación.
En la ciclización de la resina en intramolecular thio-ene descrita en la figura 3, la eliminación del grupo trityl de un residuo de cisteína fue encontrada para ser un paso crítico para la fotoreducción posterior. Además, el peso molecular de péptidos antes y tras que la reacción fue encontrada para ser idéntico como representan en la Figura 6B. Por lo tanto, el uso de una identificación de HPLC o un ensayo DTNB es necesaria para el seguimiento de la r…
The authors have nothing to disclose.
Los autores reconocen el apoyo financiero de la Fundación de subvenciones de China de Ciencias naturales (no. 21372023, 21778009 y 81701818); el Ministerio de ciencia y tecnología de la República Popular de China (Nº 2015DFA31590); el Shenzhen Ciencia y tecnología Comité de innovación (no. JCYJ20170412150719814, JCYJ20170412150609690, JCYJ20150403101146313, JCYJ20160301111338144, JCYJ20160331115853521, JSGG20160301095829250 y GJHS20170310093122365); y la Fundación de ciencia Postdoctoral de China (no. 2017 M 610704).
Rink Amide MBHA resin(0.53 mmol/g) | HECHENG | GRM50407 | |
Standard Fmoc-protected amino acids | GL Biochem (Shanghai) Ltd. | ||
N-Methyl-2-pyrrolidinone | Shenzhen endi Biotechnology Co.Ltd. | 3230 | skin harmful |
N,N-Dimethyl formamide | Energy | B020051 | skin harmful |
Dichloromethane | Energy | W330229 | skin harmful |
N,N-Diisoproylethylamine | Aldrich | 9578 | irritant |
Trifluoroacetic acid | J&K | 101398 | corrosive |
Triisopropylsilane | J&K | 973821 | |
1,2-Ethanedithiol | J&K | 248897 | Stench |
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate | GL Biochem (Shanghai) Ltd. | 851012 | |
Morpholine | Aldrich | M109062 | irritant |
Diethyl ether | Aldrich | 673811 | flammable |
Acetonitrile | Aldrich | 9758 | toxicity |
Methanol | Aldrich | 9758 | toxicity |
2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone | Energy | A050035 | |
4-methoxyacetophenone | Energy | A050098 | |
2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone | Energy | D070132 | |
5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) | J&K | 281281 | |
Benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate | Energy | E020172 | |
1-Hydroxybenzotriazole | Energy | D050256 | |
4-Methylmorpholine | Energy | W320038 | |
High Performance Liquid Chromatography | SHIMADZU | LC-30AD | |
Electrospray Ionization Mass | SHIMADZU | LCMS-8030 | |
Lyophilizer | Labconco | FreeZone | |
SpeedVac concentration system | Thermo | Savant | |
vacuum manifold | promega | A7231 | |
three-way stopcocks | Bio-Rad | 7328107 | |
poly-prep chromatography columns | Bio-Rad | 7311550 |