Summary

3' adapte CDNA hızlı amplifikasyon transkript kanser eşlemek için sona erer

Published: March 28, 2018
doi:

Summary

İki farklı 3′ hızlı amplifikasyon cDNA biter (3′ yarış) protokolleri açıklanan burada yapmak açık okuma çerçevesi (ORF), kodonu ve tüm 3′ UTR RNA kullanarak bir transkript, bir parçasını içeren dizileri iki farklı DNA polimerazlar kullanımı farklı kanser hücre satırlarından elde.

Abstract

Ökaryotik mRNA’ların olgunlaşma Poli(a) kuyruğu ilavesi içerir 3′ son oluşumu içerir. Bir gen 3′ sonu eşlemek için geleneksel seçim 3′ hızlı amplifikasyon cDNA biter (3′ yarış) yöntemidir. İletişim kuralları için 3′ yarış dikkatli tasarım ve ilgi hedef gen 3′ Çevrilmeyen bölgesi (3′ UTR) içinde iç içe geçmiş astar yelpazesi gerektirir. Ancak, bir kaç değişiklik ile protokol tüm 3′ UTR ve dizileri ORF ve 3′ UTR ilişkisi, daha kapsamlı bir görünümünü sağlayan açık okuma çerçevesi (ORF), içinde eklemek için kullanılabilir. Bu Poliadenilasyon sinyal (PAS), yanı sıra yanı sıra geleneksel 3′ tarafından yarış sağlanan dilinim ve Poliadenilasyon site kimliğidir. Genişletilmiş 3′ yarış alışılmadık 3′ UTRs içinde 3′ UTR, gen füzyon dahil olmak üzere, algılayabilir ve sırası bilgi AU transkript kararlılığını etkileyebilir öğeleri istikrarsızlaştırıcı zengin yanı sıra potansiyel miRNA bağlayıcı siteleri tahmin etmek için kullanılabilir.

Introduction

3′ ucu oluşumu pre-mRNA aşağı Poli(a) kuyruğu1,2olun ~ 250 untemplated adenines ilavesi ve ardından bir pas bölünme oluşur mRNA olgunlaşma önemli bir adım var. Poli(a) kuyruğu Poli(a) bağlayıcı protein (PABP) bağlanır ve bu mRNA transkript bozulma korur ve çeviri1kolaylaştırır.

Mevcut tahminlere insan genlerinin % 70’i birden çok giriş ve böylece alternatif Poliadenilasyon, birden fazla 3′ biter3‘ te sonuçlanan geçmesi öneririz. Böylece, nerede Poli(a) kuyruğu kalan 3′ UTR verdiği tanımlamak gibi PAS tarafından verilen herhangi bir transkript kullanılan belirlemek önemlidir. Yeni nesil sıralama gelişiyle 3′ eşzamanlı kimliği içinde UTRs ve genler binlerce PASs sonuçlandı. Bu artış sıralama özelliği, 3’ uç alternatif Poliadenilasyon içeren verileri çözümlemek için bioinformatic algoritma geliştirme gerektirmiştir. De novo algılama veya PAS doğrulanmasını ve dolayısıyla 3′ ucu bireysel genlerin büyük ölçekli sıralama veri eşleme için 3′ yarış yönteminin seçimi4,5kalır. Normalde, 3′ yarış cDNA ürünleriyle birlikte sıraları yalnızca bir bölümünü 3′ Poli(a) kuyruğu, bölünme sitesi, PAS ve akıntıya karşı dizisi PAS içerir UTR’nin içerir. Tasarım ve gen belirli ileriye ve geriye doğru astar kullanımını gerektiren PCR 3′ yarış sadece iki gen belirli iç içe ileri astar gerektirir. Dolayısıyla, PCR nükleotid dizisi güçlendirilmiş4,6olmak gen büyük bir bölgeye ilişkin daha ayrıntılı bir bilgi gerektirir. 3′ yarış başlandığından beri aynı Poli(a) kuyruğu poliadenile RNA transkriptlerinizin için hedefleri, yalnızca ileri astar gen belirli, böylece, yalnızca mRNA önemli ölçüde daha küçük bir bölge bilgisi gerektiren gerekir astar ters. Bu kimin dizileri değil tam olarak karakterize4,7olan bölgelerdeki amplifikasyon sağlar. Bu 3′ yarış sadece bir gen 3′ sonu belirlemek için aynı zamanda belirlemek ve büyük bölgelerinde akıntıya karşı önemli bir kısmını 3′ UTR formu PAS karakterize için kullanılmak üzere izin verdi. 5′ ile değiştirilmiş 3′ büyük bazı bölümleri 3′ UTR ve kanat bölgeleri içeren yarış yarış birleştirerek, tamamen sıra ya da onun 3′ son85′ uç üzerinden tüm bir mRNA transkript klon mümkündür.

Son kimliği roman CCND1-MRCK füzyon gen transkript Mantle hücreli Lenfoma hücre satırlarından ve kanser hastaları bu uygulanması değiştirilmiş 3′ yarış bir örnektir. 3′ UTR üzerinden CCND1 ile MRCK gen dizilerinin oluşuyordu ve miRNA Yönetmeliği9‘ a inatçı. İki iç içe geçmiş CCND1 belirli ileri astar hemen bitişik ve CCND1 kodonu aşağı bölgeye tamamlayıcı. Her ne kadar bütün transcriptome sıralama belirli bioinformatic araçları ile birlikte gene füzyon103′ UTR içinde algılamak için kullanılan, birçok labs mali kaynak veya yapmak için bioinformatic uzmanlık eksikliği bu teknoloji kullanın. Bu nedenle, 3′ yarış de novo tanıma ve onaylama 3′ UTR içeren roman füzyon genlerin yerine kullanılabilir. Köklü bildirilen füzyon genlerin sayısını artırmak gibi transkript okuma göz önüne alındığında, 3′ yarış gen dizileri11,12karakterize güçlü bir araç haline gelmiştir. Buna ek olarak, son yıllarda yapılan çalışmalarda bu farklı diziler içinde 3′ UTR yanı sıra uzunluğu 3′ UTR mRNA transkript istikrar, yerelleştirme, translatability ve işlev13etkileyebilir göstermiştir. Kısmen artan ilgi nedeniyle transcriptome eşleme, orada laboratuar olarak kullanılmak üzere geliştirilen farklı DNA polimerazlar sayısındaki bir artış olmuştur. Ne tür değişiklikler 3′ için DNA polimerazlar kullanılabilir repertuar yararlanmak için sipariş yarış protokolünde yapılabilir belirlemek önemlidir.

Bu eser 3′ tüm 3′ UTR eşlemek için yarış uyum raporları, PAS ve 3′ sonu bölünme bir site kullanarak ANKHD1 transkript astar transkript ve iki farklı DNA polimerazlar ANKHD1 bölümünde iç içe geçmiş.

Protocol

Önlük, eldiven ve koruyucu gözlük bu protokol için tüm yordamları gerçekleştirirken her zaman giymek. Konteyner/tüpler fenol ve guanidin isothiocyanate reaktif içeren yalnızca bir Sertifikalı hood ve dispose fenol atık belirlenmiş bir kap içinde açılan emin olun. Dnaz/RNAse-Alerjik steril tüpler, ipuçları ve Kimyasalları kullanın. 1. hücre kültürü HeLa hücre satır ve iki süspansiyon manto hücre Lenfoma hücre hatları, Granta-519 ve Jeko-1, % 10 içeren…

Representative Results

İç içe geçmiş ileri astar arama: Özel jel Şekil 1 , hangi kullanım aynı ama farklı ters astar astar ileri iki ayrı PCR jel ürün (şerit 1 ve 2) gösterir. Lane 3 ayrı bir PCR ürünü ve farklı ileriye ve geriye doğru astar vardır. Dayalı PCR reaksiyon için kullanmak için ideal astar bir ayrı PCR ürün (Lane 3) vermek bunlar. Şerit 1 ve 2 kullanılan ileri astar …

Discussion

Bir gen gen olarak büyük paralel sıralama teknolojileri gelişiyle rağmen 3′ yarış PAS ve nükleotid Poli(a) kuyruğu bitişik tanımlamak için en kolay ve en ekonomik yöntem kalıyor. Burada açıklanan adaptasyon kullanarak 3′ yarış hem yükseltmek ve ORF, kodonu ve tüm 3′ UTR ANKHD1 mRNA transkript, bir bölümünü içeren dizileri eşlemek için genişler. 3′ yarış bir büyük avantajı birkaç küçük uyarlamalar ile diğer vektörel çizimler aşağı akım sorgulama işlevinin miRNA hedefle…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bettine Gibbs teknik yardım kabul etmek istiyoruz.

Materials

HeLa cells ATCC CCL-2 Cervical cancer cell line.
Jeko-1 cells ATCC CRL-3006 Mantle cell lymphoma cell line.
Granta-519 cells DSMZ ACC-342 Mantle cell lymphoma cell line.
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F6178 Fetal bovine serum for cell culture.
Penicillin/Streptomycin ThermoFisherScientific 15140122 Antibiotic and antimycotic.
GlycoBlue Ambion AM9545 Coprecipitant.
DMEM ThermoFisherScientific 10569044 Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.
Nuclease Free-Water ThermoFisherScientific AM9938 Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution Corning 21-030 1X PBS.
Chloroform Sigma  Aldrich C7559-5VL
2-propanol Sigma Aldrich I9516
Reagent Alcohol Sigma Aldrich 793175 Ethanol
Ethidium Bromide solution Sigma Aldrich E1510
TRIzol Reagent ThermoFisherScientific 15596026 Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.
2X Extender PCR-to-Gel Master Mix Amresco N867 2X PCR-to-Gel Master Mix  containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.
10mM dNTP Amresco N557
RQ1 RNase-Free DNase Promega M6101 Dnase treatment kit.
Gel Loading Dye Orange (6X) New England BioLabs B7022S
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer ThermoFisherScientific F531S 2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.
PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase Agilent Technologies 600670 Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).
RevertAid RT Reverse Transcription Kit Thermo Fischer K1691 Used for  reverse transcription of mRNA into  cDNA synthesis. Kit includes  Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.
Pefect size 1Kb ladder 5 Prime 2500360 Molecular weight DNA ladder.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III Alpha Innotech Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel.
Low Molecular Weight Ladder New England BioLabs N3233L Molecular weight DNA ladder.
Vortex Mixer MidSci VM-3200
Mini Centrifuge MidSci C1008-R
Dry Bath MidSci DB-D1
NanoDrop 2000C ThermoFisherScientific ND-2000C Spectrophotometer.
Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System BioRad 1704469 Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel
PowerPac Basic Power Supply BioRad 1645050 Power supply for gel electrophoresis.
Agarose Dot Scientific AGLE-500
Mastercycler Gradient Eppendorf 950000015 PCR thermocycler.
Centrifuge Eppendorf 5810 R
Centrifuge Eppendorf 5430R
Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System Promega A9281
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot  TOP10 Chemically Competent E. coli cells ThermoFisherScientific K280020
MyPCR Preparation Station Mystaire MidSci MY-PCR24 Hood dedicated to PCR work.
Hamilton SafeAire II fume hood ThermoFisherScientific Fume hood.
Beckman Coulter Z1 Particle Counter Beckman Coulter 6605698 Particle counter. For counting cells before plating  for RNA extraction.
Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0 Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific) Software to analyze Sanger sequencing data.

References

  1. Mandel, C., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3′-end processing. Cell Mol Life Sci. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
  2. Danckwardt, S., Hentze, M., Kulozik, A. 3′ end mRNA processing: Molecular mechanisms and implications for health and disease. EMBO J. 27 (3), 482-498 (2008).
  3. Derti, A., et al. A quantitative atlas of polyadenylation in five mammals. Genome Res. 22 (6), 1173-1183 (2012).
  4. Sambrook, J., Russell, D. W. Rapid amplification of 3′ cDNA ends (3′-RACE). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
  5. Masamha, C. P., et al. CFIm25 regulates glutaminase alternative terminal exon definition to modulate miR-23 function. RNA. 22 (6), 830-838 (2016).
  6. Rodu, B. Molecular Biology in Medicine: The polymerase chain reaction: the revolution within. Am J Med Sci. 299 (3), 210-216 (1990).
  7. Bertioli, D., White, B. A. Rapid amplification of cDNA ends. PCR Cloning Protocols: Methods in Molecular Biology. 67, 233-238 (1997).
  8. Freeman, L. A., Freeman, L. Cloning full-length transcripts and transcript variants using 5′ and 3′ RACE. Lipoproteins and Cardiovascular Disease: Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1027, 3-17 (2013).
  9. Masamha, C. P., Albrecht, T. R., Wagner, E. J. Discovery and characterization of a novel CCND1/MRCK gene fusion in mantle cell lymphoma. J Hematol Oncol. 9 (1), 1-5 (2016).
  10. Parker, B. C., et al. The tumorigenic FGFR3-TACC3 gene fusion escapes miR-99a regulation in glioblastoma. J Clin Investig. 123 (2), 855-865 (2013).
  11. Prakash, T., et al. Expression of conjoined genes: Another mechanism for gene regulation in eukaryotes. PLOS ONE. 5 (10), e13284 (2010).
  12. Mertens, F., Johansson, B., Fioretos, T., Mitelman, F. The emerging complexity of gene fusions in cancer. Nat Rev Cancer. 15 (6), 371-381 (2015).
  13. Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3’UTRs. Trends Cell Biol. 26 (3), 227-237 (2016).
  14. International Committee For Standardization In, H., et al. Protocol for evaluation of automated blood cell counters. Clin Lab Haematol. 6 (1), 69-84 (1984).
  15. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), e2565 (2010).
  16. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
  17. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  18. Curtis, P. C., Thomas, J. L., Phillips, N. R., Roby, R. K. Optimization of primer specific filter metrics for the assessment of mitochondrial DNA sequence data. Mitochondrial DNA. 21 (6), 191-197 (2010).
  19. Letowski, J., Brousseau, R., Masson, L. Designing better probes: Effect of probe size, mismatch position and number on hybridization in DNA oligonucleotide microarrays. J Microbiol Methods. 57 (2), 269-278 (2004).
  20. Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays. Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).
  21. Singh, V. K., Govindarajan, R., Naik, S., Kumar, A. The effect of hairpin structure on PCR amplification efficiency. Mol Biol Today. 1, 67-69 (2000).
  22. Kalle, E., Kubista, M., Rensing, C. Multi-template polymerase chain reaction. Biomol Detect Quant. 2, 11-29 (2014).
  23. Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. The landscape of kinase fusions in cancer. Nat Commun. 5, 4846 (2014).

Play Video

Cite This Article
Masamha, C. P., Todd, Z. Adapting 3′ Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer. J. Vis. Exp. (133), e57318, doi:10.3791/57318 (2018).

View Video