Adattamento 3' amplificazione veloce di CDNA finisce per mappare le trascrizioni in cancro

La formazione dell’estremità 3′ è un passo fondamentale nella maturazione di mRNA che comprende il clivaggio del pre-mRNA a valle di un PAS seguita dall’aggiunta di ~ 250 tipo adenine, che compongono la coda di poli (a)^1,2. La proteina legante il poli (a) (PABP) si lega alla coda di poli (a), e questo protegge la trascrizione di mRNA da degradazione e facilita la traduzione¹.

Le stime attuali suggeriscono che il 70% dei geni umani hanno passaggio multiplo e quindi sono sottoposti ad poliadenilazione alternativa, con conseguente più 3′ estremità³. Pertanto, è importante identificare dove la coda di poli (a) si attacca al resto del 3′ UTR, nonché a identificare il PAS utilizzato da qualsiasi trascrizione dato. L’avvento di sequenziatori di ultima generazione ha provocato l’identificazione simultanea del 3′ UTR e il passaggio di migliaia di geni. Questo aumento della capacità di sequenziamento ha richiesto lo sviluppo di algoritmi bioinformatici per analizzare i dati che coinvolgono poliadenilazione alternativa dell’estremità 3′. Per l’individuazione del de novo o la convalida della PAS e quindi mapping dell’estremità 3′ dei singoli geni da dati di sequenziamento su larga scala, 3′ gara rimane il metodo di scelta^4,5. Le sequenze incluse nei prodotti di cDNA di 3′ gara normalmente includono solo una parte del 3′ UTR che contiene la coda di poli (a), il luogo di fenditura, la PAS e le sequenze a Monte della PAS. A differenza di PCR, che richiede la progettazione e la scelta del gene specifico primer forward e reverse, 3′ gara richiede solo due primers gene nidificati specifici in avanti. Quindi, la PCR richiede una conoscenza più dettagliata della sequenza del nucleotide di una grande regione del gene di essere amplificato^4,6. Dato che 3′ gara utilizza lo stesso reverse primer che obiettivi il poli (a) di coda per tutte le trascrizioni di poliadenilazione RNA, solo i primer in avanti devono essere gene specifico, così, solo che richiedono la conoscenza di una regione significativamente più piccola del mRNA. In questo modo l’amplificazione delle regioni in cui le sequenze non sono completamente caratterizzato^4,7. Questo ha permesso 3′ gara per essere utilizzato non solo per determinare l’estremità 3′ del gene, ma a anche determinare e caratterizzare grandi regioni a Monte della PAS che formano una parte significativa del 3′ UTR. Combinando 5′ corsa con modificate 3′ gara che comprende porzioni più grandi di 3′ UTR e regioni fiancheggianti, è possibile completamente di sequenza o clonare un’intero trascrizione di mRNA dall’estremità 5′ alla sua 3′ estremità⁸.

Un esempio di questa applicazione di modificate 3′ gara è la recente identificazione di un romanzo di trascrizione del gene CCND1-MRCK fusione da linee cellulari di linfoma a cellule mantellari e malati di cancro. 3′ UTR ha consistito di sequenze di geni MRCK sia il CCND1 ed era ricalcitrante a miRNA regolamento⁹. I due nidificati CCND1 avanti primers specifici erano complementari alla regione immediatamente adiacente e a valle del codone di arresto di CCND1 . Anche se l’intero trascrittoma sequenziazione insieme strumenti bioinformatici specifico può essere utilizzato per rilevare le fusioni del gene entro i 3′ UTR¹⁰, molti laboratori potrebbero mancare le risorse finanziarie o perizia di bioinformatica per fare uso di questa tecnologia. Quindi, 3′ gara è un’alternativa per de novo identificazione e validazione di geni di fusione romanzo che coinvolge il regione 3′ UTR. Considerando il drastico aumento del numero di geni di fusione segnalati nonché a leggere attraverso le trascrizioni, 3′ gara è diventata un potente strumento nella caratterizzazione genica sequenze^11,12. Inoltre, recenti studi hanno dimostrato che diverse sequenze all’interno di 3′ UTR, nonché la lunghezza del 3′ UTR può influenzare la stabilità di trascrizione mRNA, la localizzazione, la traducibilità e funzione¹³. Dovuto in parte a un crescente interesse nella mappatura del transcriptome, c’è stato un aumento del numero di differenti polimerasi del DNA in fase di sviluppo per l’utilizzo in laboratorio. È importante determinare quali tipi di modifiche possono essere reso a 3′ protocollo di gara in ordine di utilizzare il repertorio disponibile di polimerasi del DNA.

Questo lavoro rapporti adattandosi 3′ gara per mappare l’intero regione 3′ UTR, la PAS e il sito di clivaggio estremità 3′ della trascrizione ANKHD1 utilizzando nidificati Primer all’interno della sezione di ANKHD1 della trascrizione e due diversi DNA polimerasi.