تكييف 3 ' التضخيم السريع من كدنا ينتهي إلى خريطة المحاضر في السرطان
Summary
البروتوكولات اثنين مختلفة 3 ‘التضخيم السريع كدنا الغايات (3’ سباق) جعل هنا وصف استخدام اثنين بولمرس الحمض النووي مختلفة لتعيين تسلسل التي تشمل جزءا من الإطار القراءة المفتوحة (ORF) كودون التوقف وأكملها 3 ‘ UTR من نسخة باستخدام الحمض النووي الريبي الحصول على خطوط خلايا السرطان المختلفة.
Abstract
نضوج مرناس التوكسينات ينطوي على إنهاء تشكيل 3 ‘، الذي ينطوي على إضافة ذيل poly(A). من أجل تعيين 3 ‘نهاية الجين، هو الطريقة التقليدية لاختيار 3’ التضخيم السريع كدنا الغايات (3 ‘ سباق). تتطلب بروتوكولات لسباق 3 ‘التصميم الدقيق والتحديد كبسولة تفجير متداخلة ضمن 3’ المنطقة غير مترجمة (3 ‘ UTR) من الجينات المستهدفة للفائدة. ومع ذلك، مع بعض التعديلات يمكن استخدام البروتوكول لتشمل كامل 3 ‘UTR وتسلسل داخل الإطار القراءة المفتوحة (ORF)، تقديم صورة أكثر شمولاً عن العلاقة بين ORF و 3’ UTR. هذا بالإضافة إلى تحديد إشارة بوليادينيليشن (PAS)، فضلا عن موقع الانقسام وبوليادينيليشن تقدمها التقليدية 3 ‘ العرق. توسيع 3 ‘العرق يمكن الكشف عن غير عادية 3’ تحيلها، بما في ذلك اندماج الجينات داخل 3 ‘ UTR، وتسلسل المعلومات التي يمكن استخدامها للتنبؤ المحتملة ميرنا ربط المواقع، فضلا عن الاتحاد الأفريقي الغنية زعزعة العناصر التي قد تؤثر على استقرار محضر.
Introduction
تشكيل نهاية 3 ‘ هو خطوة حاسمة في نضوج مرناً التي تتألف الانقسام ومن المصب مرناً قبل نظام تقييم الأداء متبوعاً بالإضافة ~ 250 أونتيمبلاتيد أدينينيس، التي تشكل poly(A) الذيل1،2. البروتين ملزمة poly(A) (بابب) بربط ذيل poly(A)، وهذا يحمي نسخة مرناً من التدهور، ويسهل الترجمة1.
وتشير التقديرات الحالية إلى أن 70% جينات البشرية المرور متعددة، وهكذا يخضع بوليادينيليشن البديلة، أسفر عن عدة 3 ‘ ينتهي3. وبالتالي، من المهم أن تحدد فيها الذيل poly(A) تعلق على بقية 3 ‘ UTR، فضلا عن تحديد نظام تقييم الأداء المستخدمة من قبل أي نص معين. وادي ظهور الجيل التالي التسلسل في تحديد وقت واحد 3 ‘ تحيلها وتمرير الآلاف من الجينات. هذه الزيادة في القدرة على تسلسل يتطلب تطوير خوارزميات بيوينفورماتيك لتحليل البيانات التي تنطوي على بوليادينيليشن البديلة للنهاية 3 ‘. لكشف حيثياته أو التحقق من صحة نظام تقييم الأداء ومن ثم تعيين النهاية 3 ‘للجينات الفردية من البيانات تسلسل واسعة النطاق، 3’ العرق يظل أسلوب اختيار4،5. وتشمل تسلسل المدرجة في منتجات كدنا 3 ‘سباق عادة جزء فقط من 3’ UTR يحتوي على الذيل poly(A) وموقع الانقسام، ونظام تقييم الأداء، وفي تسلسل المنبع لنظام تقييم الأداء. خلافا لبكر، الأمر الذي يتطلب تصميم واستخدام الجينات محددة إلى الأمام وعكس كبسولة تفجير، 3 ‘ سباق فقط يتطلب اثنين الجينات محددة المتداخلة إلى الأمام الإشعال. ومن ثم، بكر يتطلب معرفة أكثر تفصيلاً من تسلسل النوكليوتيدات من منطقة كبيرة من الجينات يجري تضخيم4،6. منذ 3 ‘ سباق يستخدم نفس عكس التمهيدي أن أهداف الذيل poly(A) لجميع بوليادينيلاتيد الحمض النووي الريبي النصوص، إلا الإشعال إلى الأمام يجب أن تكون الجينات محددة، وبالتالي، فقط التي تتطلب معرفة بمنطقة أصغر بكثير من مرناً. وهذا يتيح تضخيم المناطق التي تسلسل لا تتسم تماما4،7. وقد سمح 3 ‘سباق لاستخدامها ليس فقط لتحديد نهاية 3’ الجينات، ولكن أيضا تحديد وتوصيف مناطق شاسعة في المنبع لنظام تقييم الأداء التي تشكل جزءا كبيرا من 3 ‘ UTR. عن طريق الجمع بين 5 ‘سباق مع معدلة 3’ سباق يتضمن أجزاء أكبر من 3 ‘UTR ومناطق الحماية، من الممكن تماما تسلسل أو استنساخ أكمله نسخة مرناً من النهاية 5’ إلى النهاية 3 ‘8.
مثال على هذا التطبيق من تعديل 3 ‘العرق هو تحديد الأخيرة من رواية CCND1-مرك الانصهار الجينات نسخة من خطوط الخلايا”اللمفاوية خلية عباءة” ومرضى السرطان. 3 ‘ UTR تتألف من تسلسل من جينات كلا من CCND1 و مرك والمعاندة لميرنا البند9. اثنين متداخلة CCND1 محددة إلى الأمام الإشعال تعتبر مكملة للمنطقة المتاخمة والمتلقين للمعلومات من كودون وقف CCND1 فورا. على الرغم من أن يمكن استخدام تسلسل الترنسكربيتوم كله جنبا إلى جنب مع أدوات بيوينفورماتيك محددة للكشف عن اندماج الجينات داخل UTR 3 ‘10، العديد من مختبرات قد تفتقر إلى الموارد المالية أو الخبرة بيوينفورماتيك لجعل استخدام هذه التكنولوجيا. ومن ثم، 3 ‘العرق بديل لتحديد حيثياته والتحقق من صحة الجينات الانصهار الرواية التي تشمل 3′ UTR. وبالنظر إلى زيادة في عدد الجينات الانصهار المبلغ عنها جذرية كذلك قراءة من خلال النصوص، 3 ‘ سباق قد أصبح أداة قوية في وصف تسلسل الجين11،12. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت دراسات أجريت مؤخرا أن تسلسلات مختلفة داخل 3 ‘UTR فضلا عن طول 3’ UTR يمكن أن تؤثر على استقرار نسخة مرناً، التعريب، طواعية، ووظيفة13. يرجع جزئيا إلى زيادة اهتمام في رسم الخرائط الترنسكربيتوم، وكان هناك زيادة في العدد من مختلف بولمرس الحمض النووي يجري تطويرها لاستخدامها في المختبر. من المهم تحديد ما أنواع التعديلات يمكن جعل 3 ‘ بروتوكول سباق في النظام باستخدام مرجع متاح للحمض النووي [بولمرس].
عمل هذه التقارير تكييف 3 ‘سباق الخريطة أكملها 3’ UTR، نظام تقييم الأداء، و 3 ‘ نهاية الانقسام والموقع من محضر ANKHD1 باستخدام كبسولة تفجير داخل القسم ANKHD1 من النسخة وهما الحمض النووي [بولمرس] مختلفة متداخلة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وعلى الرغم من ظهور تقنيات ضخمة يسلسل موازية، على أساس الجينات بالجينات، 3 ‘ سباق لا يزال الأسلوب الأسهل والأكثر اقتصادا للتعرف على نظام تقييم الأداء والنيوكليوتيدات المجاورة بذيل poly(A). تكييف الموصوفة هنا يوسع استخدام 3 ‘سباق إلى تضخيم وخريطة تسلسل التي تشمل قسما من ORF كودون التوقف و أكملها 3…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نعترف جيبس بيتين لمساعدتها التقنية.
Materials
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | Cervical cancer cell line. |
| Jeko-1 cells | ATCC | CRL-3006 | Mantle cell lymphoma cell line. |
| Granta-519 cells | DSMZ | ACC-342 | Mantle cell lymphoma cell line. |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal bovine serum for cell culture. |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisherScientific | 15140122 | Antibiotic and antimycotic. |
| GlycoBlue | Ambion | AM9545 | Coprecipitant. |
| DMEM | ThermoFisherScientific | 10569044 | Gibco brand cell culture media with GlutaMAX. |
| Nuclease Free-Water | ThermoFisherScientific | AM9938 | Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated). |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution | Corning | 21-030 | 1X PBS. |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C7559-5VL | |
| 2-propanol | Sigma Aldrich | I9516 | |
| Reagent Alcohol | Sigma Aldrich | 793175 | Ethanol |
| Ethidium Bromide solution | Sigma Aldrich | E1510 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisherScientific | 15596026 | Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent. |
| 2X Extender PCR-to-Gel Master Mix | Amresco | N867 | 2X PCR-to-Gel Master Mix containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search. |
| 10mM dNTP | Amresco | N557 | |
| RQ1 RNase-Free DNase | Promega | M6101 | Dnase treatment kit. |
| Gel Loading Dye Orange (6X) | New England BioLabs | B7022S | |
| 2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer | ThermoFisherScientific | F531S | 2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents. |
| PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase | Agilent Technologies | 600670 | Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu). |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fischer | K1691 | Used for reverse transcription of mRNA into cDNA synthesis. Kit includes Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript. |
| Pefect size 1Kb ladder | 5 Prime | 2500360 | Molecular weight DNA ladder. |
| Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III | Alpha Innotech | Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel. | |
| Low Molecular Weight Ladder | New England BioLabs | N3233L | Molecular weight DNA ladder. |
| Vortex Mixer | MidSci | VM-3200 | |
| Mini Centrifuge | MidSci | C1008-R | |
| Dry Bath | MidSci | DB-D1 | |
| NanoDrop 2000C | ThermoFisherScientific | ND-2000C | Spectrophotometer. |
| Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | BioRad | 1704469 | Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Power supply for gel electrophoresis. |
| Agarose | Dot Scientific | AGLE-500 | |
| Mastercycler Gradient | Eppendorf | 950000015 | PCR thermocycler. |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli cells | ThermoFisherScientific | K280020 | |
| MyPCR Preparation Station Mystaire | MidSci | MY-PCR24 | Hood dedicated to PCR work. |
| Hamilton SafeAire II fume hood | ThermoFisherScientific | Fume hood. | |
| Beckman Coulter Z1 Particle Counter | Beckman Coulter | 6605698 | Particle counter. For counting cells before plating for RNA extraction. |
| Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0 | Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific) | Software to analyze Sanger sequencing data. |
References
- Mandel, C., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3′-end processing. Cell Mol Life Sci. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
- Danckwardt, S., Hentze, M., Kulozik, A. 3′ end mRNA processing: Molecular mechanisms and implications for health and disease. EMBO J. 27 (3), 482-498 (2008).
- Derti, A., et al. A quantitative atlas of polyadenylation in five mammals. Genome Res. 22 (6), 1173-1183 (2012).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Rapid amplification of 3′ cDNA ends (3′-RACE). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
- Masamha, C. P., et al. CFIm25 regulates glutaminase alternative terminal exon definition to modulate miR-23 function. RNA. 22 (6), 830-838 (2016).
- Rodu, B. Molecular Biology in Medicine: The polymerase chain reaction: the revolution within. Am J Med Sci. 299 (3), 210-216 (1990).
- Bertioli, D., White, B. A. Rapid amplification of cDNA ends. PCR Cloning Protocols: Methods in Molecular Biology. 67, 233-238 (1997).
- Freeman, L. A., Freeman, L. Cloning full-length transcripts and transcript variants using 5′ and 3′ RACE. Lipoproteins and Cardiovascular Disease: Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1027, 3-17 (2013).
- Masamha, C. P., Albrecht, T. R., Wagner, E. J. Discovery and characterization of a novel CCND1/MRCK gene fusion in mantle cell lymphoma. J Hematol Oncol. 9 (1), 1-5 (2016).
- Parker, B. C., et al. The tumorigenic FGFR3-TACC3 gene fusion escapes miR-99a regulation in glioblastoma. J Clin Investig. 123 (2), 855-865 (2013).
- Prakash, T., et al. Expression of conjoined genes: Another mechanism for gene regulation in eukaryotes. PLOS ONE. 5 (10), e13284 (2010).
- Mertens, F., Johansson, B., Fioretos, T., Mitelman, F. The emerging complexity of gene fusions in cancer. Nat Rev Cancer. 15 (6), 371-381 (2015).
- Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3’UTRs. Trends Cell Biol. 26 (3), 227-237 (2016).
- International Committee For Standardization In, H., et al. Protocol for evaluation of automated blood cell counters. Clin Lab Haematol. 6 (1), 69-84 (1984).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), e2565 (2010).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Curtis, P. C., Thomas, J. L., Phillips, N. R., Roby, R. K. Optimization of primer specific filter metrics for the assessment of mitochondrial DNA sequence data. Mitochondrial DNA. 21 (6), 191-197 (2010).
- Letowski, J., Brousseau, R., Masson, L. Designing better probes: Effect of probe size, mismatch position and number on hybridization in DNA oligonucleotide microarrays. J Microbiol Methods. 57 (2), 269-278 (2004).
- Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays. Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).
- Singh, V. K., Govindarajan, R., Naik, S., Kumar, A. The effect of hairpin structure on PCR amplification efficiency. Mol Biol Today. 1, 67-69 (2000).
- Kalle, E., Kubista, M., Rensing, C. Multi-template polymerase chain reaction. Biomol Detect Quant. 2, 11-29 (2014).
- Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. The landscape of kinase fusions in cancer. Nat Commun. 5, 4846 (2014).
