Bepalen als DNA gekleurd met een Cyanine kleurstof kan worden verteerd met enzymen van de beperking
Summary
Vlekken van DNA moleculen voor fluorescentie microscopie kan een wetenschapper om ze te bekijken tijdens een experiment. In de methode die hier gepresenteerd, zijn de DNA moleculen vooraf gekleurd met fluorescente kleurstoffen en verteerd met methylation en niet-methylering gevoelige restrictie-enzymen.
Abstract
Visualisatie van DNA voor fluorescentie microscopie maakt gebruik van een verscheidenheid van kleurstoffen zoals cyanine kleurstoffen. Deze kleurstoffen worden gebruikt vanwege hun hoge affiniteit en de gevoeligheid voor DNA. Om te bepalen als de DNA moleculen volle lengte na de voltooiing van het experiment zijn, is een methode nodig om te bepalen als de gekleurde moleculen volle lengte zijn door de spijsvertering van DNA met enzymen van de beperking. Gekleurd DNA kan echter de enzymen, remmen, zodat er een methode om te bepalen welke enzymen die men voor fluorescerende gebruiken kan gekleurd DNA nodig is. Bij deze methode is DNA gekleurd met een cyanine kleurstof ‘s nachts om de kleurstof en DNA aan equilibreer. Volgende, Gebrandschilderd DNA wordt verteerd met een restrictie-enzym, geladen in een gel en electrophoresed. De experimentele DNA verteren bands worden vergeleken met een verteren in silico om te bepalen van de activiteit van het beperkingsenzym. Als er evenveel bands zoals verwacht, dan is de reactie is voltooid. Meer bands dan verwacht geven van gedeeltelijke vertering en minder banden geven onvolledige spijsvertering. Het voordeel van deze methode is de eenvoud en het gebruik van apparatuur die een wetenschapper nodig voor een restrictie-enzym hebben zou assay en gel elektroforese. Een beperking van deze methode is dat de enzymen beschikbaar voor de meeste wetenschappers verkrijgbare enzymen zijn; enzymen van de beperking kan echter worden gebruikt.
Introduction
De TOTO-serie (TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, POPO-3 en BOBO-3; Tabel 1) wordt gebruikt in een breed scala aan experimenten waarbij de visualisatie van DNA vereist1,2,3,4,5,6,7, is 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. de cyanine dimeer familie is veel gebruikt vanwege hun quantumrendement, gevoeligheid, en met hoge affiniteit voor DNA moleculen18,19,20. Cyanine dimeer kleurstoffen hebben grote selectiviteit voor dubbele gestrande DNA en bij tussenliggende hebben een 100 tot 1000-voudige toename van fluorescentie21. Pyridinium kleurstoffen (YOYO-1, TOTO-1, YOYO-3 en TOTO-3) hebben een kortere golflengte van de emissie dan hun quinolium kleurstof (BOBO-1, POPO-1, BOBO-3 en POPO-3) tegenhangers (tabel 1)22. Ook het quantumrendement voor cyanine Dimeren tussenliggende in DNA is hoog (0.2 – 0.6)22. Met behulp van een enzym te bepalen van het profiel van de methylering van een DNA-molecuul2 of rekken23 van een DNA molekuul al gekleurd met fluorescente kleurstof vereist echter een methode om te bepalen welke enzymen zal gebeitst DNA verteren. Elk type kleurstof die intercalates in DNA of een enzym dat een waarneembaar patroon van het DNA-substraat geeft kan worden gebruikt voor deze methode.
Meng et al. bepaald eerst het tarief van de spijsvertering van DNA van de prestained door middel van de Elektroforese van het gel met behulp van een verscheidenheid van verschillende kleurstoffen24. Maschmann et al. dook dieper kijken naar de TOTO-familie van kleurstoffen. Beide bepaald het percentage van de spijsvertering van gebeitst DNA te zien als DNA met een bepaalde kleurstof gekleurd met een restrictie-enzym25kan worden verteerd. Andere methoden bestuderen bindende gevolgen van kleurstoffen tussenliggende met DNA met optisch pincet26 of27van de NMR. Beide methoden vereist gespecialiseerde apparatuur; Overwegende dat met deze methode kunt apparatuur die de meeste moleculaire biologie labs hebben om te bepalen of een kleurstof interfereert met de spijsvertering van een restrictie-enzym.
Bovendien, in de andere methoden voor het meten van de lengte van een bepaalde molecule, heeft optische mapping langwerpige onbevlekt DNA moleculen op een oppervlak en verteerd van DNA om te bepalen van het stuk en de grootte van fragmenten. Bekomt van kleurstof is aangetoond dat het verhogen van de contour lengte van fluorescently gebeitst DNA moleculen en afhankelijk van de kleurstof gebruikt, de contour lengtes zijn verschillende21. Deze methode is gebruikt in een verscheidenheid van genoom1,3,4,6,13,28,29,30, 31. echter moleculen mochten vooraf gebeitst, afhankelijk van de kleurstof en enzym, het enzym kan niet zitten kundig voor snijden van DNA met een bepaalde kleurstof gekleurd. Deze methode bepaalt daarom als DNA met een bepaalde kleurstof gekleurd met een enzym kan worden verteerd. Bovendien, afhankelijk van de concentratie van de kleurstof en de kleurstof gebruikt, de mobiliteit van het DNA zal banden in een gel migreren langzamer dan de inheemse DNA als gevolg van de gedeeltelijke afwikkeling van de DNA-ruggengraat ruimte te maken voor de kleurstof moet worden ingevoegd tussen basenparen32 .
Echter soms deze kleurstoffen kunnen gedeeltelijk of volledig remmen de werking van bepaalde enzymen van de beperking7,24. Dit is vermoedelijk te wijten zijn aan een structurele verandering in het DNA veroorzaakt door de bevestiging van de fluorescerende kleurstof, die eventueel kunnen verhinderen dat het enzym herkennen de specifieke volgorde. Invloed van deze kleurstoffen op restrictie-enzymen kan helpen bij experimenten waar de methylering profiel of het traject van gebeitst DNA vereist is.
In onze werkwijze, was DNA gekleurd met een fluorescerende van belang en verteerd met een restrictie-enzym. Vervolgens DNA was electrophoresed op een gel, beeld, en de snelheid van de spijsvertering restrictie-enzym werd gemeten. De enzymen van de beperking werden gekozen op basis van de uitgesneden patroon op een gel. Te veel bands veroorzaakt overlapping van DNA bands en te weinig bands niet geven een totaalbeeld van de DNA-molecule. Er is een sweet spot te kunnen bepalen van het profiel van de verteerd DNA-molecule; Daarom zal het afhangen van de DNA gebruikt en het enzym. Een voordeel van deze methode is de eenvoud; zij vereist alleen apparaten die worden gebruikt in een beperking spijsvertering en gel elektroforese.
Protocol
Representative Results
Discussion
Om te verteren fluorescently geëtiketteerde DNA (Figuur 1), zijn een aantal stappen vereist. Eerst, DNA is gekleurd met een fluorescerende ‘s nachts. DNA kan worden geïncubeerd met cyanine Dimeren voor een kortere periode; Carlsson et al. vond echter dat DNA dubbele banden voor elke grootte van de DNA als gevolg van onvolledige kleuring20gemaakt. Om dit te verhelpen, kan het DNA overnachting om te voorkomen dubbele banden worden gekleurd. D…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gefinancierd door het Nationaal Instituut voor algemene medische wetenschap (NIGMS) (5605100122001), een onderdeel van de National Institutes of Health (NIH), evenals de Universiteit van Nebraska op Kearney (UNK) zomer Student Research Program (SSRP) en UNK Undergraduate Research Fellowship (URF).
Materials
| Unmethylated lambda DNA | NEB | N3013S | |
| YOYO-1 | ThermoFisher Scientific | Y3601 | |
| TOTO-1 | ThermoFisher Scientific | T3600 | |
| POPO-1 | ThermoFisher Scientific | P3580 | |
| BOBO-1 | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| YOYO-3 | ThermoFisher Scientific | Y3606 | |
| TOTO-3 | ThermoFisher Scientific | T3604 | |
| POPO-3 | ThermoFisher Scientific | P3584 | |
| BamHI | NEB | R0136S | |
| PmlI | NEB | R0532S | |
| ScaI | NEB | R3122S | |
| EcoRI | NEB | R0101S | |
| HindIII | NEB | R0104S | |
| SmaI | NEB | R0141S | |
| Tris | Fisher | BP152-1 | Irritant |
| EDTA | Fisher | S316-212 | Toxic |
| HCl | Fisher | S25358 | Corrosive and irritant |
| Buffer 1 | NEB | B7201S | NEB 1.1 |
| Buffer 2 | NEB | B7202S | NEB 2.1 |
| Buffer 3 | NEB | B7204S | NEB Cutsmart |
| High gelling temperature agarose gel | Lonza | 50041 | |
| Acetic Acid | Fisher | S25118 | Hazardous |
| Blue light transilluminator | Dark Reader | DR196 | Wear correct eyewear |
| Ethidium bromide | Fisher | 15585011 | Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc. |
| Cannon EOS Rebel T3I camera | Cannon | ||
| Apogee Model H4 | Biorad | 1704510 | |
| Power Pac Basic Power Supply | Biorad | 1645050 | |
| Ficoll | Fisher Scientific | BP525-25 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B-392 | |
| Xylene Cyanol | Eastmen | T1579 |
References
- Teague, B., et al. High-resolution human genome structure by single-molecule analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 10848-10853 (2010).
- Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).
- Zhou, S., et al. Validation of rice genome sequence by optical mapping. BMC Genomics. 8, 278 (2007).
- Reslewic, S., et al. Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodospirillum rubrum. Appl Environ Microbiol. 71 (9), 5511-5522 (2005).
- Zhou, S., et al. Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodobacter sphaeroides strain 2.4.1 and its use for whole-genome shotgun sequence assembly. Genome Res. 13 (9), 2142-2151 (2003).
- Gupta, A., Kounovsky-Shafer, K. L., Ravindran, P., Schwartz, D. Optical mapping and nanocoding approaches to whole-genome analysis. Microfluidics and Nanofluidics. 20 (44), 1-14 (2016).
- Kounovsky-Shafer, K. L., et al. Presentation of large DNA molecules for analysis as nanoconfined dumbbells. Macromolecules. 46 (20), 8356-8368 (2013).
- Kim, Y., et al. Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length. Lab Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).
- Yu, H., Jo, K., Kounovsky, K. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. Molecular propulsion: chemical sensing and chemotaxis of DNA driven by RNA polymerase. J Am Chem Soc. 131 (16), 5722-5723 (2009).
- Lam, E. T., et al. Genome mapping on nanochannel arrays for structural variation analysis and sequence assembly. Nat Biotechnol. 30 (8), 771-776 (2012).
- Cao, H., Tegenfeldt, J. O., Austin, R. H., Chou, S. Y. Gradient nanostructures for interfacing microfluidics and nanofluidics. Applied Physics Letters. 81 (16), 3058-3060 (2002).
- Gupta, A., et al. Single-molecule analysis reveals widespread structural variation in multiple myeloma. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (25), 7689-7694 (2015).
- Wu, C. W., Schramm, T. M., Zhou, S., Schwartz, D. C., Talaat, A. M. Optical mapping of the Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis genome. BMC Genomics. 10, 25 (2009).
- Jo, K., Schramm, T. M., Schwartz, D. C. A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis : nanocoding. Methods Mol Biol. 544, 29-42 (2009).
- Jo, K., Chen, Y. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. Elongation and migration of single DNA molecules in microchannels using oscillatory shear flows. Lab Chip. 9 (16), 2348-2355 (2009).
- Jo, K., et al. A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (8), 2673-2678 (2007).
- Reccius, C. H., Mannion, J. T., Cross, J. D., Craighead, H. G. Compression and free expansion of single DNA molecules in nanochannels. Phys Rev Lett. 95 (26), 268101 (2005).
- Staerk, D., Hamed, A. A., Pedersen, E. B., Jacobsen, J. P. Bisintercalation of homodimeric thiazole orange dyes in DNA: effect of modifying the linker. Bioconjug Chem. 8 (6), 869-877 (1997).
- Spielmann, H. P., Wemmer, D. E., Jacobsen, J. P. Solution structure of a DNA complex with the fluorescent bis-intercalator TOTO determined by NMR spectroscopy. 생화학. 34, 8542-8553 (1995).
- Carlsson, C., Jonsson, M., Akerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Res. 23 (13), 2413-2420 (1995).
- Kundukad, B., Yan, J., Doyle, P. S. Effect of YOYO-1 on the mechanical properties of DNA. Soft Matter. 10 (48), 9721-9728 (2014).
- Technologies, L. . The Molecular Probes Handbook: A guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , (2010).
- Riehn, R., et al. Restriction mapping in nanofluidic devices. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (29), 10012-10016 (2005).
- Meng, X., Cai, W., Schwartz, D. C. Inhibition of restriction endonuclease activity by DNA binding fluorochromes. J Biomol Struct Dyn. 13 (6), 945-951 (1996).
- Maschmann, A., Kounovsky-Shafer, K. L. Determination of restriction enzyme activity when cutting DNA labeled with the TOTO Dye family. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. , 1-12 (2017).
- Biebricker, A. S., et al. The impact of DNA intercalators on DNA and DNA-processing enzymes elucidated through force-dependent binding kinetics. Nature Communications. 6, 7304 (2015).
- Gunther, K., Mertig, M., Seidel, R. Mechanical and structural properties of YOYO-1 complexed DNA. Nucleic Acids Res. 38 (19), 6526-6532 (2010).
- Zhou, S., et al. A clone-free, single molecule map of the domestic cow (Bos taurus) genome. BMC Genomics. 16, 644 (2015).
- Ray, M., et al. Discovery of structural alterations in solid tumor oligodendroglioma by single molecule analysis. BMC Genomics. 14, 505 (2013).
- Chen, S., et al. Genome sequence of the model medicinal mushroom Ganoderma lucidum. Nat Commun. 3, 913 (2012).
- Zhou, S., et al. A single molecule scaffold for the maize genome. PLoS Genet. 5 (11), e1000711 (2009).
- Sischka, A., et al. Molecular mechanisms and kinetics between DNA and DNA binding ligands. Biophys J. 88 (1), 404-411 (2005).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103 (2004).
