Определение, если ДНК окрашивали цианиновые краска может быть переваривается с энзимами ограничения
Summary
Пятнать молекул ДНК для микроскопии флуоресцирования позволяет ученым, чтобы просмотреть их во время эксперимента. В методе, представленные здесь молекулы ДНК предварительно окрашенные с флуоресцентными красителями и переваривается Метилировани и не метилирования чувствительные энзимы ограничения.
Abstract
Визуализация ДНК для микроскопии флуоресцирования использует различные красители например цианиновые красители. Эти красители используются благодаря их высоким сродством и чувствительности для ДНК. Для того чтобы определить если молекулы ДНК, полная длина после завершения эксперимента, чтобы определить если окрашенных молекул являются полная длина, переваривание ДНК с энзимами ограничения требуется метод. Однако окрашенных ДНК может тормозить ферментов, поэтому метод, чтобы определить, какие ферменты, можно было бы использовать для флюрохром окрашенных ДНК. В этом методе ДНК запачкается с цианиновые красителя на ночь для красителя и ДНК, чтобы сбалансировать. Далее, окрашенных ДНК переваривается с энзима ограничения, загружается в гель и electrophoresed. Экспериментальной группы ДНК дайджест по сравнению с в silico дайджест для определения активности энзима ограничения. Если есть такое же количество полос, как и ожидалось, реакция является полной. Больше полосы, чем ожидалось, указать частичный пищеварение и меньше полосы указывают неполное переваривание. Преимуществом этого метода является его простота, и он использует оборудование, что ученый потребуется для энзима ограничения пробирного и электрофорез геля. Ограничение этого метода является то, что ферменты для большинства ученых коммерчески доступных ферментов; Однако могут использоваться любые энзимов ограничения.
Introduction
Тото серии (Тото-1, YOYO-1, Попо-1, БОБО-1, Тото-3, YOYO-3, Попо-3 и БОБО-3; Таблица 1) используется в самых разнообразных экспериментов, где визуализация ДНК является требуется1,2,3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. семьи димер цианиновые широко используется из-за их квантовый выход, чувствительность и высокое сродство для ДНК молекул18,19,20. Димер цианиновые красители имеют большой избирательности для двойной мель ДНК и когда интеркалированного 100 до 1000 раз увеличение флуоресценции21. Пиридиния красители (YOYO-1, Тото-1, YOYO-3 и Тото-3) имеют короче длина волны излучения, чем их quinolium краситель (БОБО-1, Попо-1, БОБО-3 и Попо-3) коллегами (Таблица 1)22. Кроме того, высокий квантовый выход для цианиновые димеры интеркалированного в ДНК (0,2 – 0,6)22. Однако с помощью фермента определить профиль метилирования ДНК молекула2 или растянуть23 молекулы ДНК, уже окрашивали Люминесцентную краску требует метод для определения, какие ферменты будет переваривать окрашенных ДНК. Для этого метода может использоваться любой тип красителя, который встраивается в ДНК или каких-либо фермента, который дает ощутимый характер субстрат ДНК.
Мэн et al. сначала определяется скорость переваривания prestained ДНК через гель-электрофорез с использованием целого ряда различных красителей24. Maschmann et al. вникал в глубже взглянуть на Тото семьи красителей. Как определяется уровень пищеварение окрашенных ДНК, чтобы увидеть, если ДНК, окрашенных краской заданного могут быть осмыслены с энзима ограничения25. Другие методы изучения воздействия привязки красителей, интеркалированного с ДНК, используя Оптический пинцет26 или27ЯМР. Либо метод требует специализированного оборудования; принимается во внимание, что этот метод позволяет оборудование, большинство лабораторий молекулярной биологии должны определить, если краска вмешивается Пищеварение энзима ограничения.
Кроме того в других методах, чтобы измерить длину данной молекулы, оптические сопоставления удлиненные неокрашенных молекул ДНК на поверхности и переваривается ДНК для определения участка и размер фрагментов. Было показано интеркаляции краска увеличить длину контура дневно окрашенных молекул ДНК и в зависимости от используемых красителях, контур колея различные21. Этот метод был использован в различных геномов1,3,4,6,13,28,,2930, 31. Однако, если молекулы были предварительно окрашенные, в зависимости от краски и фермента, фермент может не иметь возможность вырезать ДНК, окрашенных краской заданного. Таким образом этот метод определяет, если ДНК, окрашенных краской заданного могут быть осмыслены с ферментом. Кроме того в зависимости от концентрации красителя и краска использована, подвижности ДНК полос в геле перенесет более медленно, чем родной ДНК из-за частичного раскручивание ДНК позвоночника чтобы освободить место для красителя для вставки между пар32 .
Однако иногда эти красители могут частично или полностью препятствовать действий некоторых энзимов ограничения7,24. Это считается вследствие структурных изменений в ДНК, вызванные вложение Люминесцентную краску, которая может помешать признавая ее определенной последовательности фермента. Понимание, как эти красители влияют на энзимов ограничения может помочь в экспериментах, где требуется метилирования профиль или растягивать окрашенных ДНК.
В нашем методе ДНК был окрашенных с флюрохром интерес и переваривается с энзима ограничения. Затем был electrophoresed ДНК на геле, образы, и была измерена скорость пищеварения энзима ограничения. Энзимы ограничения были выбраны на основании вырезать узор на гель. Слишком много диапазонов вызвало Перекрытие полос ДНК и слишком мало полос не дают полную картину молекулы ДНК. Есть сладкое пятно, чтобы иметь возможность определить профиль переваривается молекулы ДНК; Таким образом он будет зависеть от используемых ДНК и фермента. Преимуществом данного метода является его простота; Он только требует оборудования, используемого в ограничение пищеварение и гель-электрофорез.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для того, чтобы переваривать дневно обозначенные ДНК (рис. 1), требуется ряд шагов. Во-первых ДНК запачкается с флюрохром на ночь. ДНК может быть инкубировали с цианиновые димеры на более короткий период времени; Однако Carlsson et al. обнаружил, что ДНК создан двой?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось национальным институтом для общей медицинской науки (NIGMS) (5605100122001), компонент национальных институтов здравоохранения (НИЗ), а также Университет штата Небраска в Кирни (UNK) летние студенческие исследования программы (SSRP) и UNK Стипендия студентов исследований (ЕФД).
Materials
| Unmethylated lambda DNA | NEB | N3013S | |
| YOYO-1 | ThermoFisher Scientific | Y3601 | |
| TOTO-1 | ThermoFisher Scientific | T3600 | |
| POPO-1 | ThermoFisher Scientific | P3580 | |
| BOBO-1 | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| YOYO-3 | ThermoFisher Scientific | Y3606 | |
| TOTO-3 | ThermoFisher Scientific | T3604 | |
| POPO-3 | ThermoFisher Scientific | P3584 | |
| BamHI | NEB | R0136S | |
| PmlI | NEB | R0532S | |
| ScaI | NEB | R3122S | |
| EcoRI | NEB | R0101S | |
| HindIII | NEB | R0104S | |
| SmaI | NEB | R0141S | |
| Tris | Fisher | BP152-1 | Irritant |
| EDTA | Fisher | S316-212 | Toxic |
| HCl | Fisher | S25358 | Corrosive and irritant |
| Buffer 1 | NEB | B7201S | NEB 1.1 |
| Buffer 2 | NEB | B7202S | NEB 2.1 |
| Buffer 3 | NEB | B7204S | NEB Cutsmart |
| High gelling temperature agarose gel | Lonza | 50041 | |
| Acetic Acid | Fisher | S25118 | Hazardous |
| Blue light transilluminator | Dark Reader | DR196 | Wear correct eyewear |
| Ethidium bromide | Fisher | 15585011 | Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc. |
| Cannon EOS Rebel T3I camera | Cannon | ||
| Apogee Model H4 | Biorad | 1704510 | |
| Power Pac Basic Power Supply | Biorad | 1645050 | |
| Ficoll | Fisher Scientific | BP525-25 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B-392 | |
| Xylene Cyanol | Eastmen | T1579 |
References
- Teague, B., et al. High-resolution human genome structure by single-molecule analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 10848-10853 (2010).
- Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).
- Zhou, S., et al. Validation of rice genome sequence by optical mapping. BMC Genomics. 8, 278 (2007).
- Reslewic, S., et al. Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodospirillum rubrum. Appl Environ Microbiol. 71 (9), 5511-5522 (2005).
- Zhou, S., et al. Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodobacter sphaeroides strain 2.4.1 and its use for whole-genome shotgun sequence assembly. Genome Res. 13 (9), 2142-2151 (2003).
- Gupta, A., Kounovsky-Shafer, K. L., Ravindran, P., Schwartz, D. Optical mapping and nanocoding approaches to whole-genome analysis. Microfluidics and Nanofluidics. 20 (44), 1-14 (2016).
- Kounovsky-Shafer, K. L., et al. Presentation of large DNA molecules for analysis as nanoconfined dumbbells. Macromolecules. 46 (20), 8356-8368 (2013).
- Kim, Y., et al. Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length. Lab Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).
- Yu, H., Jo, K., Kounovsky, K. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. Molecular propulsion: chemical sensing and chemotaxis of DNA driven by RNA polymerase. J Am Chem Soc. 131 (16), 5722-5723 (2009).
- Lam, E. T., et al. Genome mapping on nanochannel arrays for structural variation analysis and sequence assembly. Nat Biotechnol. 30 (8), 771-776 (2012).
- Cao, H., Tegenfeldt, J. O., Austin, R. H., Chou, S. Y. Gradient nanostructures for interfacing microfluidics and nanofluidics. Applied Physics Letters. 81 (16), 3058-3060 (2002).
- Gupta, A., et al. Single-molecule analysis reveals widespread structural variation in multiple myeloma. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (25), 7689-7694 (2015).
- Wu, C. W., Schramm, T. M., Zhou, S., Schwartz, D. C., Talaat, A. M. Optical mapping of the Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis genome. BMC Genomics. 10, 25 (2009).
- Jo, K., Schramm, T. M., Schwartz, D. C. A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis : nanocoding. Methods Mol Biol. 544, 29-42 (2009).
- Jo, K., Chen, Y. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. Elongation and migration of single DNA molecules in microchannels using oscillatory shear flows. Lab Chip. 9 (16), 2348-2355 (2009).
- Jo, K., et al. A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (8), 2673-2678 (2007).
- Reccius, C. H., Mannion, J. T., Cross, J. D., Craighead, H. G. Compression and free expansion of single DNA molecules in nanochannels. Phys Rev Lett. 95 (26), 268101 (2005).
- Staerk, D., Hamed, A. A., Pedersen, E. B., Jacobsen, J. P. Bisintercalation of homodimeric thiazole orange dyes in DNA: effect of modifying the linker. Bioconjug Chem. 8 (6), 869-877 (1997).
- Spielmann, H. P., Wemmer, D. E., Jacobsen, J. P. Solution structure of a DNA complex with the fluorescent bis-intercalator TOTO determined by NMR spectroscopy. 생화학. 34, 8542-8553 (1995).
- Carlsson, C., Jonsson, M., Akerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Res. 23 (13), 2413-2420 (1995).
- Kundukad, B., Yan, J., Doyle, P. S. Effect of YOYO-1 on the mechanical properties of DNA. Soft Matter. 10 (48), 9721-9728 (2014).
- Technologies, L. . The Molecular Probes Handbook: A guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , (2010).
- Riehn, R., et al. Restriction mapping in nanofluidic devices. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (29), 10012-10016 (2005).
- Meng, X., Cai, W., Schwartz, D. C. Inhibition of restriction endonuclease activity by DNA binding fluorochromes. J Biomol Struct Dyn. 13 (6), 945-951 (1996).
- Maschmann, A., Kounovsky-Shafer, K. L. Determination of restriction enzyme activity when cutting DNA labeled with the TOTO Dye family. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. , 1-12 (2017).
- Biebricker, A. S., et al. The impact of DNA intercalators on DNA and DNA-processing enzymes elucidated through force-dependent binding kinetics. Nature Communications. 6, 7304 (2015).
- Gunther, K., Mertig, M., Seidel, R. Mechanical and structural properties of YOYO-1 complexed DNA. Nucleic Acids Res. 38 (19), 6526-6532 (2010).
- Zhou, S., et al. A clone-free, single molecule map of the domestic cow (Bos taurus) genome. BMC Genomics. 16, 644 (2015).
- Ray, M., et al. Discovery of structural alterations in solid tumor oligodendroglioma by single molecule analysis. BMC Genomics. 14, 505 (2013).
- Chen, S., et al. Genome sequence of the model medicinal mushroom Ganoderma lucidum. Nat Commun. 3, 913 (2012).
- Zhou, S., et al. A single molecule scaffold for the maize genome. PLoS Genet. 5 (11), e1000711 (2009).
- Sischka, A., et al. Molecular mechanisms and kinetics between DNA and DNA binding ligands. Biophys J. 88 (1), 404-411 (2005).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103 (2004).
