Summary

Amplificazione isotermica multiplex basato su piattaforma diagnostica per rilevare Zika, Chikungunya e Dengue 1

Published: March 13, 2018
doi:

Summary

Corrente multiplexed diagnostica per rilevare virus dengue, chikungunya e Zika richiedono preparazione campioni complessi e costosi strumentazione e sono difficili da utilizzare in ambienti di risorse in esaurimento. Vi mostriamo una diagnostica che utilizza amplificazione isotermica con sonde displaceable strand mirate per rilevare e distinguere questi virus con alta sensibilità e specificità.

Abstract

Zika, dengue e chikungunya virus vengono trasmessi dalle zanzare, che causano malattie con sintomi simili del paziente. Tuttavia, hanno potenzialità di trasmissione paziente–paziente a valle diversi e richiedono trattamenti pazienti molto diversi. Così, recenti focolai di Zika rendono urgente di sviluppare strumenti che discriminano rapidamente questi virus in pazienti e intrappolato le zanzare, per selezionare il corretto trattamento del paziente e per comprendere e gestire la loro epidemiologia in tempo reale.

Purtroppo, attuale test diagnostici, tra cui quelli emergenza 2016 ricevente utilizzare autorizzazioni e fast track stato, rilevare RNA virale da reazione a catena della polimerasi d’inversione della trascrizione (RT-PCR), che richiede strumentazione, addestrato gli utenti, e preparazione del campione considerevole. Così, essi devono essere inoltrati ai laboratori di riferimento “approvato”, che richiede tempo. Infatti, in agosto 2016, il Center for Disease Control (CDC) stava chiedendo donne incinte che era stato morso da una zanzara e ha sviluppato un’eruzione che indica Zika aspettare un’inaccettabile 2 a 4 settimane prima di imparare se sono stati infettati. Abbiamo molto bisogno di test che può essere fatto sul posto, con poche risorse e da personale addestrato ma non necessariamente con licenza.

Questo video dimostra un’analisi che soddisfa queste specifiche, lavorando con urina o siero (per pazienti) o carcasse di zanzara schiacciata (per sorveglianza ambientale), tutto senza molta preparazione del campione. Carcasse di zanzara vengono catturate su carta che trasportano gruppi ammonio quaternario (Q-carta) seguite da trattamento con ammoniaca per gestire rischi biologici. Questi sono quindi direttamente, senza isolamento del RNA, messi in provette contenenti i reagenti liofilizzati che hanno bisogno di nessuna catena di refrigerazione. Una forma modificata di trascrizione d’inversione ciclo-amplificazione isotermica mediata da con mirate fluorescente contrassegnati spostabile sonde produce della lettura, in 30 min, come un segnale di fluorescenza in tre colori. Questo viene visualizzato con un dispositivo palmare, alimentato a batteria con un filtro arancione. Contaminazione di avanti è evitata con provette sigillate e l’uso di uracile termolabile DNA glicosilasi (UDG) in presenza di dUTP nella miscela di amplificazione.

Introduction

Le infezioni virali trasmesse dalle zanzare, incluse dengue e chikungunya virus di Zika sono sulle strategie di gestione immediata ascesa e la domanda. Dengue e chikungunya virus sono già endemico in molte regioni tropicali dove Zika sta ormai dilagando in emisfero occidentale1. Virus di Zika, come dengue, è un membro della famiglia Flaviviridae ed è originario dell’Africa con una asiatica e due stirpi genetici africano2. Anche se l’identificazione del virus Zika risale al 1947, Zika infezione in esseri umani è rimasto sporadico per mezzo secolo prima di emergere nel Pacifico e nelle Americhe. Il primo focolaio segnalato di Zika febbre si è verificato su Isola di Yap, Stati federati di Micronesia nel 2007, seguita da Polinesia francese nel 2013 e nel 2014. Il primo focolaio principale nelle Americhe si è verificato nel 2015 in Brasile.

I virus di Zika, chikungunya e dengue sono principalmente trasmessi da Aedes aegypti e Aedes albopictus. Tuttavia, Zika ha trasmissione umano–umana a valle ulteriori possibilità, probabilmente viene diffuso attraverso il contatto sessuale, l’interazione madre-di-feto e tramite l’allattamento3,4,5. Zika febbre prima credeva di causare una malattia solo lieve. Tuttavia, fu più tardi associato con la sindrome di Guillain-Barré in adulti, microcefalia in neonati e malattie del sistema muscoloscheletrico cronici che possono durare mesi e anni. Diagnosi di malattia di Zika può essere difficile, poiché i sintomi di un’infezione di Zika sono simili a quelli di altri di zanzara-diffondere virus6. Co-infezioni comuni di questi virus fanno diagnosi differenziale ancora più impegnativo7,8. Pertanto, rilevazione rapida e affidabile degli acidi nucleici da Zika e altri virus è necessario per comprendere l’epidemiologia in tempo reale, per avviare il controllo e le misure preventive e di gestire la cura paziente9.

Test diagnostici correnti per questi virus includono analisi sierologiche, isolamento del virus, sequenziamento del virus e PCR d’inversione-trascrizione (RT-PCR). Gli approcci sierologici standard spesso soffrono di sensibilità inadeguata e risultati possono essere complicati da reattività crociata in pazienti che sono stati infettati in precedenza da altri flavivirus.

Di conseguenza, degli acidi nucleici testing rimane il modo più affidabile per rilevare e distinguere questi virus. Rilevamento di Zika e altri virus zanzara è di solito eseguita mediante RT-PCR o RT-PCR in tempo reale in varietà di fluidi biologici, come siero, urina, saliva, sperma, latte materno e fluido cerebrale10,11. Campioni di urina e saliva sono generalmente preferiti sopra anima, poiché esibiscono meno PCR-inibizione, più alti carichi virali, presenza di virus per lunghi periodi di tempo e una maggiore facilità di raccolta e gestione delle12,13. Test diagnostici basati su RT-PCR, tuttavia, comprendere la procedura di preparazione del campione vasto e costose attrezzature ciclismo termica, rendendolo meno ottimale per il point-of-care.

Retrotrascrizione amplificazione isotermica mediata da loop (RT-LAMP) è emerso come una potente alternativa di RT-PCR, grazie alla sua elevata sensibilità e specificità14,15, campioni di relativa tolleranza per sostanze inibitorie in biologico e operazione singola temperatura, che significativamente si abbassa tenore complessità e costi associati, che lo rende adatto per ambienti di risorse in esaurimento. RT-LAMP, come classicamente è implementato, comprende sei iniettori che si legano a otto regioni distinte all’interno del RNA dell’obiettivo. Funziona a temperature costanti tra 60 ° C e 70 ° C e utilizza una trascrittasi inversa e una polimerasi del DNA con filo forte spostando attività.

Durante le fasi iniziali di RT-LAMP, avanti e indietro interni iniettori (FIP e BIP, Figura 1A) con primer esterno avanti e indietro (F3 e B3) formano una struttura con manubri, la struttura di seme di amplificazione esponenziale di lampada. Amplificazione è ulteriormente accelerato tramite i ciclo avanti e indietro gli iniettori (LF e LB), che sono progettati per associare le singole regioni non recuperabili di dumbbell, e risultati nella formazione di concatemeri con ripetere più cicli16. LAMPADA classica analisi basata su torbidità o lettura di DNA intercalanti coloranti non è completamente adatta per rilevazione di point-of-care di Zika, dove un certo livello di multiplazione è voluto17,18,19. Multiplexing non è facilmente ottenuti in questi sistemi, come sono inclini a generare falsi positivi a causa di amplificazioni fuori bersaglio.

Per gestire questi problemi, la letteratura aggiunge un componente supplementare sotto forma di una “filo-spostando la sonda” il21,20,di architettura classica RT-LAMP22. Ogni sonda è una regione del doppio filamento di sequenza-specifico e una regione di adescamento singolo filamento. La sonda con la regione di singolo filamento è etichettata con un fluoroforo 5′ e la sonda complementare viene modificata con un quencher estremità 3′. In assenza di un obiettivo, fluorescenza non è osservata a causa di ibridazione dei fili sonda complementare, che porta il fluoroforo e quencher in stretta vicinanza. In presenza di un bersaglio, la porzione di filamento singolo della sonda fluorescente si lega al suo complementare sul bersaglio e viene quindi esteso da un filamento spostando della polimerasi. Ulteriore estensione della polimerasi di iniettori d’inversione provoca la separazione del filo del quencher dal suo filone fluorescente contrassegnati complementari, consentendo l’emissione di fluorescenza (Figura 1B). Con questo disegno, il segnale viene generato dopo la formazione di dumbbell, riducendo le possibilità di falsi positivi segnali.

La parte di double-stranded della sonda strand-spostando può essere qualsiasi sequenza, e quando viene applicato il multiplexing, la stessa sequenza può essere utilizzata con coppie diverse fluorophore-quencher. Con questa architettura, contaminati dal virus dell’urina, siero o zanzara campioni schiacciati sulla carta sono stati introdotti direttamente il dosaggio senza preparazione del campione. Letture di tre colori di fluorescenza visibile all’occhio umano sono stati generati all’interno di 30-45 min, e i segnali sono stati visualizzati da una finestra di osservazione 3D-stampato che utilizza un LED blu e un filtro arancione. Liofilizzazione i reagenti RT-LAMP attivata la distribuzione di questo kit per abbassare le impostazioni delle risorse senza la necessità di refrigerazione.

Protocol

Nota: Le zanzare erano gli unici animali direttamente utilizzati in questo studio. Le procedure per la gestione di polli, il cui sangue è stato utilizzato per alimentare le zanzare infette, sono state approvate come IACUC protocollo n. 201507682 dalla propagazione University of Florida istituzionali cura degli animali e uso Committee.Virus e gli studi di infezione zanzara erano eseguite presso l’impianto di BSL-3 del laboratorio di entomologia medica Florida a Vero Beach, FL. RT-LAMP esperimenti sono stati eseguiti in l…

Representative Results

Inizialmente, le prestazioni di ogni primer RT-LAMP (tabella 1) con il suo corrispondente virale RNA substrato così come controlli negativi sono state valutate mediante elettroforesi in gel. Primer RT-LAMP sono stati progettati per NS5 regione target (RNA polimerasi RNA-dipendente) Zika e Dengue 1 e nsP2 regione (proteine non strutturali P2) per Chikungunya. Modelli erano RNA totale Estratto da stock virali coltivati in cellule di rene (Vero) cercopiteco africano. In un …

Discussion

Zanzara virus compreso Zika, chikungunya e dengue minacciano la salute pubblica ed evidenziazione di focolai Zika risale la necessità di alternative di rilevazione di point-of-care di basso costo per la diagnostica del paziente, nonché per la sorveglianza di zanzara. Come alternative a prezzi accessibili ai sistemi basati su PCR sono stati sviluppati metodi di amplificazione isotermica. In particolare, sono state applicate piattaforme basate su RT-lampada per rilevare un’ampia gamma di agenti patogeni. Tuttavia, l’uso …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Il lavoro è stato sostenuto in parte da FDOH-7ZK15 e NIAID 1R21AI128188-01. Ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta in parte dal National Institutes of Allergy e malattie infettive e in parte da Biomedical Research programma di Florida Department of Health. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del NIH o Florida Department of Health. LLC di chimica combinatoria dinamico è riconosciuto per il loro sostegno e contributo a questo progetto.

Virus di febbre rompiossa 1 (ceppo BOL-KW010) è stato gentilmente fornito dal dipartimento di Florida salute Bureau dei laboratori. Virus di Zika e variante asiatica del virus chikungunya sono stati gentilmente forniti dai centri per controllo e la prevenzione. Il lignaggio di oceano indiano di chikungunya virus era gentilmente fornito da Robert Tesh (centro di riferimento mondiale per virus d’emersione e gli arbovirus, attraverso l’Università del Texas Medical Branch a Galveston, in Texas) per l’UF-FMEL. Ringraziamo S. Bellamy, B. Eastmond, S. Ortiz, D. Velez, K. Wiggins, ZimLer r. e K. Zirbel per assistenza con gli studi di infezione. Ringraziamo anche M. S. Kim per la fornitura di Q-carta.

Materials

SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUS Major Science MBE-150 Gel electrophoresis
G:BOX F3 Syngene G:BOX F3 Gel imaging
LightCycler 480 Instrument II, 96-well Roche Applied Science 05 015 278 001 Real-time PCR
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane Millipore Sigma UFC501096 ultrafiltraton membrane for dialysis
Eppendorf 5417C Centrifuge Marshall Scientific EP-5417C centrifuge
Myblock Mini Drybath Benchmark Scientific BSH200 drybath
FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry System Labconco 7934020 lyophilizer
all priers and probes IDT custom RT-LAMP primers and probes
dNTP set Bioline BIO-39049
Deoxyuridine Triphosphate (dUTP) Promega U1191
Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase New England Biolabs M0538L enzyme
WarmStart RTx Reverse Transcriptase New England Biolabs M0380L enzyme
RNase Inhibitor, Murine New England Biolabs M0314L enzyme
Antarctic Thermolabile UDG New England Biolabs M0372L enzyme
50bp DNA Step Ladder Promega G4521 marker
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white Roche Applied Science 4729692001 real-time RT-LAMP analysis

References

  1. Patterson, J., Sammon, M., Garg, M. Dengue, Zika and Chikungunya: Emerging Arboviruses in the New World. Western Journal of Emergency Medicine. 17 (6), 671-679 (2016).
  2. Faye, O., et al. Molecular Evolution of Zika Virus during Its Emergence in the 20th Century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (1), e2636 (2014).
  3. Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (1952).
  4. Musso, D., Gubler, D. J. Zika Virus. Clin Microbiol Rev. 29, (2016).
  5. Musso, D. Zika Virus Transmission from French Polynesia to Brazil. Emerging Infectious Diseases. 21 (10), 1887-1887 (2015).
  6. Gasque, P., Bandjee, M. C. J., Reyes, M. M., Viasus, D. Chikungunya Pathogenesis: From the Clinics to the Bench. The Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 5), S446-S448 (2016).
  7. Villamil-Gómez, W. E., et al. Zika, dengue, and chikungunya co-infection in a pregnant woman from Colombia. International Journal of Infectious Diseases. 51, 135-138 (2016).
  8. Sardi, S. I. Coinfections of Zika and Chikungunya viruses in Bahia, Brazil, identified by metagenomic next-generation sequencing. J Clin Microbiol. 54, (2016).
  9. Shukla, S., Hong, S. -. Y., Chung, S. H., Kim, M. Rapid Detection Strategies for the Global Threat of Zika Virus: Current State, New Hypotheses, and Limitations. Frontiers in Microbiology. 7, 1685 (2016).
  10. Jesse, J. W., et al. Single-Reaction Multiplex Reverse Transcription PCR for Detection of Zika, Chikungunya, and Dengue Viruses. Emerging Infectious Disease journal. 22 (7), 1295 (2016).
  11. Pabbaraju, K., et al. Simultaneous detection of Zika, Chikungunya and Dengue viruses by a multiplex real-time RT-PCR assay. Journal of Clinical Virology. 83, 66-71 (2016).
  12. Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. Journal of Clinical Virology. 68, 53-55 (2015).
  13. Gourinat, A. C., O’Connor, O., Calvez, E., Goarant, C., Dupont-Rouzeyrol, M. Detection of zika virus in urine. Emerg Infect Dis. 21, (2015).
  14. Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28, (2000).
  15. Edwards, T., Burke, P. A., Smalley, H. B., Gillies, L., Hobbs, G. Loop-mediated isothermal amplification test for detection of Neisseria gonorrhoeae in urine samples and tolerance of the assay to the presence of urea. J Clin Microbiol. 52, (2014).
  16. Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 16, (2002).
  17. Tian, B., et al. Attomolar Zika virus oligonucleotide detection based on loop-mediated isothermal amplification and AC susceptometry. Biosensors and Bioelectronics. 86, 420-425 (2016).
  18. Wang, X., et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).
  19. Song, J., et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).
  20. Yaren, O., et al. Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya. BMC Infectious Diseases. 17 (1), 293 (2017).
  21. Kubota, K., Jenkins, D. M., Alvarez, A. M., Su, W. W. Fret-based assimilating probe for sequence-specific real-time monitoring of loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Biol. Eng. Trans. 4, 81-100 (2011).
  22. Kubota, R., Jenkins, D. M. Real-Time Duplex Applications of Loop-Mediated AMPlification (LAMP) by Assimilating Probes. Int. J. Mol. Sci. 16 (3), 4786-4799 (2015).
  23. Li, J., Macdonald, J. Advances in isothermal amplification: novel strategies inspired by biological processes. Biosens Bioelectron. 64, (2015).
  24. Pickett, B. E. ViPR: an open bioinformatics database and analysis resource for virology research. Nucleic Acids Res. 40, (2012).
  25. Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32, (2004).
  26. Boonham, N. Methods in virus diagnostics: from ELISA to next generation sequencing. Virus Res. 186, (2014).
  27. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215, (1990).
  28. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Journal of visualized experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
  29. Reiskind, M. H., Pesko, K., Westbrook, C. J., Mores, C. N. Susceptibility of Florida Mosquitoes to Infection with Chikungunya Virus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 78 (3), 422-425 (2008).
  30. Glushakova, L. G., et al. Detection of chikungunya viral RNA in mosquito bodies on cationic (Q) paper based on innovations in synthetic biology. Journal of Virological Methods. 246, 104-111 (2017).
  31. Hsieh, K., Mage, P. L., Csordas, A. T., Eisenstein, M., Tom Soh, H. Simultaneous elimination of carryover contamination and detection of DNA with uracil-DNA-glycosylase-supplemented loop-mediated isothermal amplification (UDG-LAMP). Chemical Communications. 50 (28), 3747-3749 (2014).
  32. Tang, Y., Chen, H., Diao, Y. Advanced uracil DNA glycosylase-supplemented real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (UDG-rRT-LAMP) method for universal and specific detection of Tembusu virus. Sci Rep. 6, 27605 (2016).
  33. Thomas, A. H. Fluorescence of pterin, 6-formylpterin, 6-carboxypterin and folic acid in aqueous solution: pH effects. Photochem Photobiol Sci. 1, (2002).
  34. Wu, D., Lehane, M. J. Pteridine fluorescence for age determination of anopheles mosquitoes. Med Vet Entomol. 13, (1999).
  35. Janis, A. M. Inactivation and environmental stability of Zika virus. Emerg Infect Dis J. 22, (2016).
  36. Poloni, T. R., et al. Detection of dengue virus in saliva and urine by real time RT-PCR. Virology Journal. 7 (1), 22 (2010).
  37. Jones, P., Okeoma, C. Detection of Chikungunya virus (CHIKV) in urine of infected mice: a potential non-invasive diagnostic tool for CHIKV. J Infect Dis Ther. 3 (4), 1000226 (2015).
  38. Glushakova, L. G., et al. High-throughput multiplexed xMAP Luminex array panel for detection of twenty two medically important mosquito-borne arboviruses based on innovations in synthetic biology. J. Virol. Methods. 214, 60-74 (2015).
  39. Yaren, O., Benner, S. A. Loop Mediated Amplifications with Nucleoside Analogs. US Provisional patent. , (2016).

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Yaren, O., Alto, B. W., Bradley, K. M., Moussatche, P., Glushakova, L., Benner, S. A. Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1. J. Vis. Exp. (133), e57051, doi:10.3791/57051 (2018).

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