Çoğaltılmış izotermal amplifikasyon Zika, Chikungunya ve dang 1 tespit etmek için teşhis platformu dayalı

Sivrisinek yoluyla bulaşan virüs enfeksiyonları, Dang, chikungunya ve Zika virüsler de dahil olmak üzere yükselişi ve isteğe bağlı Acil Yönetim Stratejileri vardır. Dang ve chikungunya virüs zaten endemik birçok tropikal bölgelerin nerede Zika şimdi Batı Yarımküre¹yayılıyor. Zika virüs, Dang gibi Flaviviridae ailesinin üyesi olan ve bir Asya ve iki Afrika genetik soy²ile Afrika’e. Zika virüs tanımlaması geri 1947 için Tarih rağmen Pasifik ve Amerika’nın ortaya çıkan önce yarım yüzyıl için Zika enfeksiyon insanlarda, tek tük kaldı. 2007’de, Mikronezya Federal Devletleri Yap Adası üzerinde ateş oluştu Zika ilk bildirilen patlak 2013 ve 2014 Fransız Polinezyası tarafından takip ettim. Amerika’nın ilk büyük patlak 2015 yılında Brezilya’da oluştu.

Zika, chikungunya ve dang virüs öncelikle Aedes aegypti ve Aedes albopictustarafından iletilir. Ancak, Zika ek aşağı akım insandan insana iletim olanakları, büyük olasılıkla anne fetus etkileşim, cinsel temas yoluyla ve^3,4,5emzirme yoluyla yaymak vardır. Zika ateş ilk sadece hafif hastalığa neden inanılıyordu. Ancak, daha sonra Yetişkin Guillain-Barré Sendromu, microcephaly Yenidoğan Bebeklerin ve yıl için geçen ay olabilir Kronik kas-iskelet hastalıkları ile ilişkili. Zika Enfeksiyon belirtileri bu diğer sivrisinek-yayılan virüs⁶benzer beri Zika hastalık tanısında, zor olabilir. Bu virüslerin ortak işbirliği enfeksiyonlar ayırıcı tanı daha da zorlu^7,8olun. Bu nedenle, hızlı ve güvenilir Zika ve diğer virüs nükleik asitlerden tespiti Epidemiyoloji gerçek zamanlı olarak kontrol ve önleyici tedbirler başlatmak ve hasta bakımı⁹yönetmek için anlamak için gereklidir.

Bu virüsler için geçerli tanı sınamaları serolojik testler, virüs yalıtım, virüs sıralama ve ters transkripsiyon PCR (RT-PCR) içerir. Standart serolojik yaklaşımlar genellikle yetersiz hassasiyeti muzdarip ve sonuçları olan daha önce diğer flaviviruses tarafından enfekte hastalarda tarafından karmaşık.

Bu nedenle, nükleik asit test algılamak ve bu virüsler ayırt etmek için en güvenilir yol kalır. Zika ve diğer sivrisinek yoluyla bulaşan virüs algılama genellikle RT-PCR ya da gerçek zamanlı RT-PCR biyolojik sıvıları, serum, idrar, tükürük, meni, anne sütü ve serebral sıvı^10,11gibi çeşitli kullanılarak gerçekleştirilir. Onlar sergi beri daha az PCR-inhibisyon, daha yüksek viral yük, virüs varlığı daha uzun süreler ve artan koleksiyonu ve^12,13Taşıma kolaylığı için idrar ve tükürük örnekleri üzerinde kan, genellikle tercih edilir. RT-PCR tabanlı tanı testleri ancak, kapsamlı örnek hazırlık adımları ve daha az bakım noktası için en iyi yapmak pahalı termal Bisiklete binme ekipman oluştururlar.

Ters transkripsiyon izotermal amplifikasyon (RT-lamba) döngü-aracılı yüksek duyarlılık ve özgüllük¹⁴nedeniyle güçlü bir RT-PCR alternatif olarak ortaya çıkmıştır, onun dayanıklılık için inhibitör maddelerin biyolojik örnekleri¹⁵, ve önemli ölçüde düşürür karmaşıklığı ve ilgili maliyetler, düşük kaynak ortamları için uygun hale tahlil tek sıcaklık işlem. Klasik uygulandığı gibi RT-lamba, sekiz farklı bölgelere hedef RNA içinde bind altı astar oluşmaktadır. 60 ve 70 ° C arasında sabit sıcaklıklarda çalışır ve bir ters transkriptaz ve DNA polimeraz güçlü strand etkinlik yerinden kullanır.

RT-lamba ilk aşamalarında, ileriye ve geriye doğru iç astar (FIP ve BIP, şekil 1A) dış ileriye ve geriye doğru astar (F3 ve B3) ile birlikte bir dumbbell yapısı, üstel lamba amplifikasyon tohum yapısını oluştururlar. Amplifikasyon daha da halter tek telli bölgelerinde bağlamak için tasarlanmış olan döngü ileriye ve geriye doğru astar tarafından (Eğer ve LB), hızlandırılmış ve birden fazla tekrarlayan olan concatemers oluşumu sonuçlarında döngüler¹⁶. Klasik lamba dayalı bulanıklık deneyleri veya^17,18,19Zika çoğullama bazı düzeyde nerede, bakım nokta tespiti istenen okuma boyalar enterkalasyon DNA tarafından tamamen uygun değildir. Yanlış-mutlak hedef kapalı Arttırımlar nedeniyle oluşturmak eğilimli oldukları gibi çoğullama kolayca bu sistemlerinde alınır değil.

Bu sorunları yönetmek için edebiyat klasik RT-lamba mimari^20,21,22‘ ye bir “strand yerini değiştirerek sonda” şeklinde başka bir bileşen ekler. Her sonda fingerprinting iki iplikçikli bölge ve bir tek iplikçikli astar bölgesi vardır. Sonda ile tek iplikçikli bölge bir 5′-fluorophore ile etiketlenir ve tamamlayıcı sonda 3’ uç içki ile değiştirilir. Bir hedef olmaması durumunda, fluorophore ve içki yakın getiren hibridizasyon tamamlayıcı sonda iplikçiklerinin nedeniyle hiçbir Floresans görülmektedir. Bir hedef huzurunda floresan sonda tek iplikçikli bölümünü hedef, tamamlayıcı bağlar ve sonra polimeraz yerinden bir iplikçik tarafından genişletilmiş. Daha fazla polimeraz uzantısı ters astar tarafından içki Strand Floresan ()şekil 1B)emisyon izin onun fluorescently etiketli iplikçik, gelen ayrılma nedenleri. Bu tasarım ile sinyal yanlış sinyalleri şansını azaltır dumbbell oluşumu sonra oluşturulur.

Strand yerini değiştirerek sonda çift iplikçikli bölümü herhangi bir sıra olabilir ve çoğullama uygulandığında, aynı sıra farklı fluorophore-içki çiftleri ile kullanılabilir. Bu mimari, virüs bulaşmış idrar, serum veya sivrisinek ile kağıt üzerinde squished örnekleri doğrudan örnek hazırlık yapmadan tahlil tanıtıldı. Üç renkli floresan okuma insan gözüyle 30-45 dk içinde oluşturulan ve sinyalleri bir mavi LED ve turuncu bir filtre kullanan bir 3D baskılı gözlem kutusunun tarafından görüntülenmiştir. RT-lamba reaktifler dağılması soğutma gerek olmadan kaynak ayarları düşürmek için bu kit dağıtımını etkin.