Summary

Весьма деликатного и количественного обнаружения белков и их изоформы методом капиллярной изоэлектрической упором

Published: September 19, 2018
doi:

Summary

Капиллярного изоэлектрической фокусировки является метод на основе антител, сверхчувствительная, высокая пропускная способность, позволяя подробную характеристику белков и их изоформы биологических пробах крайне мала. Ниже описывается протокол для обнаружения и количественного определения специфических белков и их изоформы автоматизированные и роботизированные образом.

Abstract

Immunoblotting стала обычной техники во многих лабораториях для характеризации белка из биологических образцов. Следующий протокол предоставляет альтернативную стратегию, капиллярные изоэлектрической фокусировки (главный), с много преимуществ по сравнению с обычными immunoblotting. Это на основе антител, автоматизированных, быстрое и количественный метод, в котором полный западных blotting процедуры происходит внутри ультратонких капилляров. Этот метод не требует гель для передачи мембраны, зачистки помарки, или рентгеновские пленки, которые обычно требуются для обычных immunoblotting. Здесь, протеины разделены согласно их заряда (Изоэлектрическая точка; Пи), используя меньше, чем микролитр (400 nL) общего белка lysate. После электрофореза, белки являются иммобилизованных на стенки капилляров, ультрафиолетовый свет лечения, следуют первичный и вторичный (пероксидазы (ПХ) конъюгированных) Антитело инкубации, привязку которого обнаруживается через расширение Хемилюминесценция (ЭСЛ), создавая световой сигнал, который может быть захвачен и Записанная камерой зарядовой (связью ПЗС). Цифровые изображения могут быть проанализированы и количественно (площадь пика) с помощью программного обеспечения. Эта процедура высокая пропускная способность может обрабатывать 96 образцов одновременно; очень чувствительна, с обнаружением белка в диапазоне пикограмм; и производит высоко воспроизводимые результаты благодаря автоматизации. Все эти аспекты являются чрезвычайно ценными, когда количество образцов (например, образцы тканей и биопсии) является ограничивающим фактором. Методика имеет более широкое применение, включая скрининг наркотиков или антител, открытия биомаркеров и диагностических целей.

Introduction

Капиллярные изоэлектрической упором (главный) является автоматизированной, основанный на капиллярной иммуноанализ, устраняющее белков на основе их заряда1,2,3. Это очень воспроизводимость и способный разрешать белков и их post-translationally модифицированных изоформ быстро и количественно. Она представляет альтернативу обычные методы, такие как Западный blotting. В то время как Западный blotting очень хорошо для подтверждающих наличие обильные белков в легкодоступном образцов; изменчивость, время потребления и точный количественный всех присутствующих задач, в частности при рассмотрении образцы биологических тканей. Действительно, изменчивость присущие проблема в Западный blotting, как есть многочисленные шаги, связанные, например, загрузки и запуска гелях SDS-PAGE, перенос белков на мембраны, инкубации с различными реагентами (например., начальное и среднее антитела, ЭСЛ) и развитие на рентгеновской пленки4. В настоящее время западные blotting метод улучшается с осуществлением цифровой записи хемилюминесцентный сигналов (цифровой вестерны). Недавно автоматизированная система западных blotting был разработан, а именно капилляра Западной, которая является более свободные руки и гель свободной системы. Весь assay автоматически после загрузки образца пластины (образцы с всеми необходимыми реагентами) в системе3,4. Инструмент будет выполнять все шаги, такие, как разделение белков, иммобилизации белков на капиллярной стенки, инкубаций антитела, моет между различные шаги и развитием и количественная оценка хемилюминесцентный сигналов. Таким образом главный представленные здесь приведен выше разрешение и чувствительность.

Этот метод является чувствительной, как сигналы могут быть созданы и количественно от пикограмм1белки. Высокая чувствительность с отличную воспроизводимость делает эту технологию очень полезным для анализа клинических образцов. Он может обнаружить, а также отличить пост поступательные изменения (например, различные фосфорилированных белка изоформ) белков. Эта технология успешно используется для рассечения различных сигнальных путей4,5 , в клинических исследованиях, направленных на разработку новой терапии рака3, и он имеет большой потенциал для обнаружения белковых биомаркеров и наркотиков .

Protocol

1. клетки культуры, стимуляции и Lysis Примечание: Этот метод может использоваться с многие типы клеток. Чтобы проиллюстрировать метод, описан пример использования человеческого пупочную вену эндотелиальных клеток (HUVECs). Культура HUVECs на желатин покрытием, 10 см Петри в ?…

Representative Results

Дизайн новой пробирного: Пробирного пластины схема приведена на рисунке 1A. Максимально 96 скважин может использоваться от 384-ну пластины в блоках 12 скважин для каждого условия (антител). Каждый блок 12 скважин можно запустить либо из A1-A12 и A13-A24. Цв…

Discussion

Чувствительность и разрешение белки имеют решающее значение для протеомических исследований биологических образцов. Существует большое значение в состоянии обнаружить белки, которые присутствуют в минуту количествах в клетках. Главный может предложить улучшена чувствительность и ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Автор благодарит Claesson профессор Лена-валлийский, Университет Уппсалы, Швеция для ее поддержки для разработки этого проекта. Кроме того Автор благодарит Росс Смит и Клаессон Лена-валлийский, Уппсальского университета за их критического чтения и предложения для улучшения рукопись.

Materials

NanoPro 1000 ProteinSimple
Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plug ProteinSimple 040-972 Ampholyte premix
DMSO inhibitor mix ProteinSimple 040-510 Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used
Aqueous Inhibitor Mix ProteinSimple 040-482 Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used
pI standard ladder 3 ProteinSimple 040-646 For cIEF 1:60 dilution used
Sample diluent ProteinSimple 040-649
Antibody diluent  ProteinSimple 040-309
Wash concentrate ProteinSimple 041-108
Anolyte Refill ProteinSimple 040-337
Catholyte Refill ProteinSimple 040-338
Peroxide XDR ProteinSimple 041-084
Luminol ProteinSimple 040-652
Bicine/CHAPS Lysis Buffer ProteinSimple 040-764
Capillaries-Charge Separation (1 pack) for  ProteinSimple CBS700
Assay Plate/Lid Kit ProteinSimple 040-663
Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)  Jackson ImmunoResearch  711-035-152 For cIEF used (1: 300)
Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)  Jackson ImmunoResearch  715-035-150 For cIEF used (1: 300)
Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody Cell Signaling 9101 For cIEF used (1: 50)
Pan Erk Primary Antibody Cell Signaling 9102 For cIEF used (1: 100)
Compass software ProteinSimple
HUVEC ATCC PCS-100-010
MV2 (EBM-2) PromoCell  C-22221 Endothelia cell basal medium
Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack PromoCell C-39221 Supplementation to MV2 above
VEGFA PeproTech 100-20
Long R3 IGF Sigma-Aldrich 85580C/I1146 Insulin-like growth factor
Bioruptor (Sonicator) Diagenode B01020001
BCA Protein Assay kit  Thermo Fischer Scientific 23225
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Thermo Fischer Scientific NP0322BOX
NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X) Thermo Fischer Scientific NP0001
NuPAGE Transfer Buffer (20X) Thermo Fischer Scientific NP0006
Immobilon PVDF membrane Millipore IPVH00010
Microfuge tube vortexer
Centrifuge
Microtiter plate adapter for centrifuge
Pipettors 
Tips
Ice

References

  1. O’Neill, R. A., et al. Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).
  2. Aspinall-O’Dea, M., et al. Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines. Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).
  3. Fan, A. C., et al. Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens. Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).
  4. Padhan, N., et al. High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer. BMC Cancer. 16 (1), 683 (2016).
  5. Sun, Z., et al. VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd. J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).
  6. Iacovides, D. C., et al. Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay. Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).
  7. Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
  8. Unger, F. T., et al. Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue. J Transl Med. 14, 6 (2016).
  9. Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice. PLoS One. 11 (1), e0146994 (2016).
  10. Schmidt, L., et al. Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene. Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).

Play Video

Cite This Article
Padhan, N. Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method. J. Vis. Exp. (139), e56794, doi:10.3791/56794 (2018).

View Video