Summary

단백질 및 모 세관 전자 초점 방법으로 그들의 Isoforms의 매우 민감하고 정량적 검출

Published: September 19, 2018
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Summary

모 세관 전자 초점 단백질과 매우 작은 생물 학적 샘플에서 그들의 isoforms의 상세한 특성을 사용 하는 항 체 기반, 磁, 높은 처리량 기법입니다. 다음 자동화 하 고 운반할 방식 검색 및 특정 단백질과 그들의 isoforms의 정량화에 대 한 프로토콜을 설명합니다.

Abstract

Immunoblotting 생물학 견본에서 단백질 특성에 대 한 많은 실험실에서 일상적인 기술 되고있다. 대체 전략을 제공 하는 다음 프로토콜, 기존의 immunoblotting 모 세관 (cIEF), 많은 장점을가지고 초점 전자 비교. 이는 완전 한 서쪽 더 럽 히 절차 수행 ultrathin 모 세관 내부 항 체 기반, 자동, 급속 한, 및 양적 방법입니다. 이 기술은 젤 막,도 말의 스트립 전송 필요 또는 기존의 immunoblotting에 일반적으로 필요한 영화를 x 선 하지 않습니다. 여기, 단백질 분리 (전자 포인트, pI) 그들의 책임에 따라, 사용 하 여 보다는 microliter (400 nL) 총 단백질 lysate의. 전기 이동 법, 후 단백질 자외선 빛 치료, 기본 및 보조 (양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 활용)에 의해 모 세관 벽에 움직일 수 있다 항 체 외피, 누구의 바인딩을 통해 감지 향상 화학 (ECL), 점령 하 고 전 하 결합 소자 (CCD) 카메라에 의해 기록 된 수 있는 광 신호를 생성 한다. 디지털 이미지 분석 될 수 있다 및 계량 (피크 지역) 소프트웨어를 사용 하 여. 이 높은 처리량 절차 한 번;에 96 샘플을 처리할 수 있습니다 매우 민감한, picogram 범위의; 단백질 검출 그리고 자동화 때문에 높은 재현성 결과 생산입니다. 이러한 측면의 모두 매우 귀중 한 때 (예를 들어, 조직 샘플 및 생 검) 샘플의 수량 제한 요소입니다. 기술은 더 넓은 응용 프로그램 뿐만 아니라, 약물 또는 항 체, 바이오 마커 발견 및 진단 목적으로의 심사를 포함 하 여 있다.

Introduction

모 세관 전자 초점 (cIEF) 그들의 충전1,2,3에 근거 하 여 단백질을 확인 하는 자동화 된, 모 세관 기반 immunoassay입니다. 그것은 매우 재현 하 고 신속 하 고 양적 단백질과 그들의 post-translationally 수정된 isoforms를 해결 하기 위한 능력입니다. 그것은 서쪽에 게 더 럽 히기와 같은 기존의 방법에 대안을 선물 한다. 매우 쉽게 액세스할 수 있는 샘플;에 풍부한 단백질의 존재 확인에 대 한 좋은 서쪽에 게 더 럽 히기 다양성, 시간 소비, 및 정확한 정량 모두 존재 도전, 특히 생물학 조직 샘플을 검사 하는 경우. 실제로, 다양성 서쪽 blotting에 고유의 문제는, 거기에 수많은 단계 참여, 로드 및 SDS 페이지 젤의 실행, 전송, 막에는 단백질의 다양 한 시 약으로 부 화 (., 기본 및 보조 항 체, ECL), x 선 필름4에 개발. 현재, 서쪽 더 럽 히 기술 chemiluminescent 신호 (디지털 westerns)의 디지털 기록의 구현 개선 이다. 최근, 자동화 된 서쪽 더 럽 히 시스템 개발 되었습니다, 즉 모 세관 서 부, 보다 핸 즈 프리 하 고 젤 무료 시스템입니다. 전체 분석 결과 시스템3,4에 샘플 플레이트 (샘플 모든 필요한 시 약을)의 로드에 따라 자동입니다. 악기는 단백질 분리 등 모든 단계를 수행 합니다 다른 단계, 그리고 개발 및 정량화 chemiluminescent 신호 사이 모 세관 벽, 항 체 외피 단백질의 동원 정지 세척. 따라서, 여기에 제시 된 cIEF 절차는 높은 해상도 감도 제공 합니다.

이 메서드는 중요 한 신호를 생성 고 단백질1의 picograms에서 측정할 수 있습니다. 우수한 재현성 높은 감도이 기술을 임상 샘플의 분석을 위해 매우 유용 하다. 그것은 수 탐지 뿐 아니라 단백질의 포스트 번역 상 수정 (예: 다른 phosphorylated 단백질 isoforms) 구별. 이 기술을 성공적으로 사용 되었습니다 다른 신호 통로4,53, 새로운 치료제 개발을 목표로 하는 임상 연구를 해 부하 고 단백질 바이오 마커 및 약물 발견에 대 한 큰 가능성이 있다 .

Protocol

1. 세포 문화, 자극, 및 세포의 용 해 참고:이 방법은 많은 세포 유형으로 사용할 수 있습니다. 방법을 설명 하기 위해 예를 들어 인간의 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVECs)를 사용 하 여 설명 되어 있습니다. 적절 한 보충과 내 피 세포 기저 매체에서 10 cm 배양 접시 젤라틴 코팅에 HUVECs 문화 ( 재료의 표참조), 또한 5 S, 표 피 성장 인자 (5 ng/mL), 혈관 내 피 성장 ?…

Representative Results

디자인의 새로운 분석 결과: 분석 결과 플레이트 레이아웃 그림 1A에 표시 됩니다. 극대, 96 웰 스 384-잘 접시 12 웰 스의 블록에서에서 각 조건 (항 체)에 대 한 사용할 수 있습니다. 12 우물의 각 블록 A1-A12 또는 A13-A24에서 시작할 수 있습니다. 색상 코드 행 하나 다른 샘플 또는 시 약을 구별할 수 있습니다. 분석 결과 서식 파일 (<strong class="x…

Discussion

감도 및 단백질의 해상도 proteomic 연구 생물 학적 샘플에 대 한 중요 한 있습니다. 셀에 분 수량에 존재 하는 단백질을 감지할 수 있게 되 고 큰 가치가 있다. cIEF는 향상 된 감도 단백질과 그들의 isoforms4의 검출에 대 한 해상도 제공할 수 있습니다.

이 기술은 많은 proteomic 연구 보고서5,,67에…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 교수 레나 Claesson-웨일스어, 웁살라 대학, 스웨덴이이 프로젝트 개발을 위한 그녀의 지원에 대 한 감사 합니다. 또한, 저자 로스 스미스와 레나 Claesson-웨일스어, 웁살라 대학 그들의 중요 한 읽기 및 원고를 개선 하기 위한 제안을 위한 감사 합니다.

Materials

NanoPro 1000 ProteinSimple
Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plug ProteinSimple 040-972 Ampholyte premix
DMSO inhibitor mix ProteinSimple 040-510 Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used
Aqueous Inhibitor Mix ProteinSimple 040-482 Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used
pI standard ladder 3 ProteinSimple 040-646 For cIEF 1:60 dilution used
Sample diluent ProteinSimple 040-649
Antibody diluent  ProteinSimple 040-309
Wash concentrate ProteinSimple 041-108
Anolyte Refill ProteinSimple 040-337
Catholyte Refill ProteinSimple 040-338
Peroxide XDR ProteinSimple 041-084
Luminol ProteinSimple 040-652
Bicine/CHAPS Lysis Buffer ProteinSimple 040-764
Capillaries-Charge Separation (1 pack) for  ProteinSimple CBS700
Assay Plate/Lid Kit ProteinSimple 040-663
Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)  Jackson ImmunoResearch  711-035-152 For cIEF used (1: 300)
Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)  Jackson ImmunoResearch  715-035-150 For cIEF used (1: 300)
Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody Cell Signaling 9101 For cIEF used (1: 50)
Pan Erk Primary Antibody Cell Signaling 9102 For cIEF used (1: 100)
Compass software ProteinSimple
HUVEC ATCC PCS-100-010
MV2 (EBM-2) PromoCell  C-22221 Endothelia cell basal medium
Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack PromoCell C-39221 Supplementation to MV2 above
VEGFA PeproTech 100-20
Long R3 IGF Sigma-Aldrich 85580C/I1146 Insulin-like growth factor
Bioruptor (Sonicator) Diagenode B01020001
BCA Protein Assay kit  Thermo Fischer Scientific 23225
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Thermo Fischer Scientific NP0322BOX
NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X) Thermo Fischer Scientific NP0001
NuPAGE Transfer Buffer (20X) Thermo Fischer Scientific NP0006
Immobilon PVDF membrane Millipore IPVH00010
Microfuge tube vortexer
Centrifuge
Microtiter plate adapter for centrifuge
Pipettors 
Tips
Ice

References

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Cite This Article
Padhan, N. Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method. J. Vis. Exp. (139), e56794, doi:10.3791/56794 (2018).

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