Detecção altamente sensível e quantitativa de proteínas e suas isoformas pelo método isoeléctrica capilar
Summary
Isoeléctrica capilar é uma técnica baseada em anticorpos, ultra-sensível, alta taxa de transferência, permitindo a caracterização detalhada de proteínas e suas isoformas das amostras biológicas extremamente pequenas. A seguir descreve um protocolo para a detecção e quantificação de proteínas específicas e suas isoformas de forma automatizada e robotizada.
Abstract
Immunoblotting tornou-se uma técnica de rotina em muitos laboratórios para caracterização de proteínas de amostras biológicas. O protocolo seguinte fornece uma estratégia alternativa, capilar isoeléctrico de focagem (cIEF), com muitas vantagens em relação ao convencional immunoblotting. Este é um método baseado em anticorpos, automatizado, rápido e quantitativo, em que um procedimento completo de mancha ocidental ocorre dentro de um capilar ultrafino. Esta técnica não exigem um gel para transferir a uma membrana, remoção de manchas, ou filmes, que são geralmente necessários para immunoblotting convencional de raios-x. Aqui, as proteínas são separadas de acordo com sua carga (ponto isoelétrico; pI), usando menos do que um microlitro (400 nL) de lisado de proteína total. Após a electroforese, proteínas são imobilizadas nas paredes capilares por tratamento com luz ultravioleta, seguido pelo primário e secundário (peroxidase de rábano (HRP) conjugado) reforçada de incubação do anticorpo, cuja ligação é detectada através de quimioluminescência (ECL), gerando um sinal luminoso que pode ser capturado e gravado por uma câmera do dispositivo de carga acoplada (CCD). A imagem digital pode ser analisada e quantificado (área do pico) utilizando o software. Este procedimento de alta taxa de transferência pode manipular 96 amostras de cada vez; é altamente sensível, com deteção de proteína na faixa de picograma; e produz resultados altamente reprodutível devido à automação. Todos estes aspectos são extremamente valiosos, quando a quantidade de amostras (por exemplo, amostras de tecidos e biópsias) é um fator limitante. A técnica tem aplicações mais amplas, incluindo rastreio de drogas ou anticorpos, descoberta de biomarker e fins de diagnóstico.
Introduction
Focalização isoelétrica capilar (cIEF) é um imunoensaio automatizado, baseado em capilar que resolve as proteínas com base em sua carga1,2,3. É altamente reprodutível e capaz de resolver proteínas e suas isoformas post-translationally modificadas rapidamente e quantitativamente. Apresenta uma alternativa aos métodos convencionais, como mancha ocidental. Enquanto mancha ocidental é muito bom para confirmar a presença de proteínas abundantes nas amostras prontamente acessíveis; variabilidade, consumo de tempo e quantificação exacta todos os presentes desafios, nomeadamente aquando da análise de amostras de tecidos biológicos. De fato, a variabilidade é um problema inerente na mancha ocidental, pois há várias etapas envolvidas, tais como carregamento e execução de geles de SDS-PAGE, transferência de proteínas na membrana, incubação com vários reagentes (EG., primário e secundário anticorpos, ECL) e desenvolvimento para filme de raio-x4. Atualmente, a técnica de mancha ocidental está melhorando com a implementação de gravação digital de sinais quimioluminescente (Western digital). Recentemente, um sistema automatizado de mancha ocidental foi desenvolvido, nomeadamente o capilar ocidental, que é um sistema mais mãos-livres e sem gel. O ensaio inteiro é automático após o carregamento de um prato de amostras (amostras com todos os reagentes necessários) para o sistema de3,4. O instrumento irá executar todas as etapas, tais como a separação de proteínas, imobilização de proteínas na parede capilar, a incubação do anticorpo, lava entre diferentes etapas e desenvolvimento e quantificação dos sinais de quimioluminescência. Assim, o procedimento de cIEF aqui apresentado fornece maior resolução e sensibilidade.
Este método é sensível, como os sinais podem ser gerados e quantificados de picogramas de proteínas1. A elevada sensibilidade com excelente reprodutibilidade torna esta tecnologia muito útil para a análise de amostras clínicas. Ele pode detectar bem como distinguir post translacional modificação (por exemplo, proteína fosforilada diferentes isoformas) de proteínas. Esta tecnologia tem sido usada com sucesso para dissecar diferentes sinalização percursos4,5 em estudos clínicos, com o objetivo de desenvolver novas terapêuticas em câncer3, e tem grande potencial para a descoberta de biomarcadores e drogas de proteína .
Protocol
Representative Results
Discussion
Sensibilidade e resolução de proteínas são cruciais para a investigação de proteomic em amostras biológicas. Há grande valor em ser capaz de detectar as proteínas que estão presentes em quantidades nas células. cIEF pode oferecer melhorou a sensibilidade e resolução para a detecção de proteínas e suas isoformas4.
Esta tecnologia tem sido usada com sucesso em muitos proteomic pesquisa relatórios5,6</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O autor agradece Prof Lena Claesson-galês, Universidade de Uppsala, na Suécia, o seu apoio para o desenvolvimento deste projeto. Além disso, o autor agradece Ross Smith e Lena Claesson-galês, Universidade de Uppsala por sua leitura crítica e sugestões para melhorar o manuscrito.
Materials
| NanoPro 1000 | ProteinSimple | ||
| Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plug | ProteinSimple | 040-972 | Ampholyte premix |
| DMSO inhibitor mix | ProteinSimple | 040-510 | Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used |
| Aqueous Inhibitor Mix | ProteinSimple | 040-482 | Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used |
| pI standard ladder 3 | ProteinSimple | 040-646 | For cIEF 1:60 dilution used |
| Sample diluent | ProteinSimple | 040-649 | |
| Antibody diluent | ProteinSimple | 040-309 | |
| Wash concentrate | ProteinSimple | 041-108 | |
| Anolyte Refill | ProteinSimple | 040-337 | |
| Catholyte Refill | ProteinSimple | 040-338 | |
| Peroxide XDR | ProteinSimple | 041-084 | |
| Luminol | ProteinSimple | 040-652 | |
| Bicine/CHAPS Lysis Buffer | ProteinSimple | 040-764 | |
| Capillaries-Charge Separation (1 pack) for | ProteinSimple | CBS700 | |
| Assay Plate/Lid Kit | ProteinSimple | 040-663 | |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | For cIEF used (1: 300) |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For cIEF used (1: 300) |
| Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody | Cell Signaling | 9101 | For cIEF used (1: 50) |
| Pan Erk Primary Antibody | Cell Signaling | 9102 | For cIEF used (1: 100) |
| Compass software | ProteinSimple | ||
| HUVEC | ATCC | PCS-100-010 | |
| MV2 (EBM-2) | PromoCell | C-22221 | Endothelia cell basal medium |
| Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack | PromoCell | C-39221 | Supplementation to MV2 above |
| VEGFA | PeproTech | 100-20 | |
| Long R3 IGF | Sigma-Aldrich | 85580C/I1146 | Insulin-like growth factor |
| Bioruptor (Sonicator) | Diagenode | B01020001 | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Fischer Scientific | 23225 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fischer Scientific | NP0322BOX | |
| NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0001 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0006 | |
| Immobilon PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Microfuge tube vortexer | |||
| Centrifuge | |||
| Microtiter plate adapter for centrifuge | |||
| Pipettors | |||
| Tips | |||
| Ice |
References
- O’Neill, R. A., et al. Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).
- Aspinall-O’Dea, M., et al. Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines. Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).
- Fan, A. C., et al. Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens. Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).
- Padhan, N., et al. High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer. BMC Cancer. 16 (1), 683 (2016).
- Sun, Z., et al. VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd. J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).
- Iacovides, D. C., et al. Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay. Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Unger, F. T., et al. Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue. J Transl Med. 14, 6 (2016).
- Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice. PLoS One. 11 (1), e0146994 (2016).
- Schmidt, L., et al. Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene. Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).
