Summary

Détection très sensible et Quantitative des protéines et leurs isoformes par isoélectrofocalisation capillaire méthode

Published: September 19, 2018
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Summary

La focalisation isoélectrique capillaire est une technique de base d’anticorps, ultrasensible, haut débit, ce qui permet une caractérisation détaillée de protéines et leurs isoformes de très petits échantillons biologiques. Ce qui suit décrit un protocole pour la détection et la quantification des protéines spécifiques et leurs isoformes de manière automatisée et robotisée.

Abstract

Immunoblotting est devenue une technique courante dans de nombreux laboratoires pour la caractérisation de protéines provenant d’échantillons biologiques. Le protocole suivant fournit une autre stratégie, capillaire isoélectrique en se concentrant (cIEF), avec de nombreux avantages comparé à conventionnel immunoblotting. Il s’agit d’une méthode axée sur les anticorps, automatisée, rapide et quantitative, dans lequel une procédure complète de transfert occidentale se déroule à l’intérieur d’un tube capillaire ultramince. Cette technique ne nécessite un gel de transférer à une membrane, décapage des taches, ni aux rayons x des films qui sont habituellement requis pour immunoblotting classique. Ici, les protéines sont séparées selon leur charge (point isoélectrique ; pI), à l’aide de moins d’un microlitre (400 nL) de lysat de protéine total. Après électrophorèse, les protéines sont immobilisés sur la paroi des capillaires de traitement par la lumière ultraviolette, suivie de primaire et secondaire (peroxydase de raifort (HRP) conjuguée) amélioré d’incubation d’anticorps, dont liaison détectée par le biais chimiluminescence (ECL), générant un signal lumineux qui peut être capturé et enregistré par une caméra à dispositif à couplage de charge (CCD). L’image numérique peut être analysé et quantifié (aire du PIC) à l’aide de logiciels. Cette procédure de haut débit peut gérer 96 échantillons à la fois. est très sensible, avec détection de protéines dans la gamme picogramme ; et produit des résultats hautement reproductible en raison de l’automatisation. Tous ces aspects sont extrêmement précieuses lorsque la quantité d’échantillons (par exemple, des échantillons de tissus et biopsies) est un facteur limitant. La technique a des applications plus larges, y compris le dépistage des drogues ou des anticorps, découverte de biomarqueurs et des fins de diagnostic.

Introduction

Isoélectrofocalisation capillaire (cIEF) est un test immunologique automatisé, axée sur les capillaires qui résout des protéines sur la base de leurs frais1,2,3. Il est hautement reproductible et capable de résoudre les protéines et leurs isoformes modifiées post-traductionnellement rapidement et quantitativement. Il présente une alternative aux méthodes classiques comme le western blot. Alors que le western blot est très bon pour confirmer la présence de protéines abondantes dans les échantillons facilement accessibles ; variabilité, consommation de temps et dosage précis tous présents défis, en particulier lors de l’examen des échantillons de tissus biologiques. En effet, la variabilité est un problème inhérent à éponger occidental, qu’il y a nombreuses étapes, telles que le chargement et fonctionnement des gels SDS-PAGE, transfert des protéines sur membrane, incubation avec différents réactifs (e.g., primaire et secondaire anticorps, ECL) et le développement sur x-ray film4. Actuellement, la technique western blot s’améliore avec la mise en œuvre de l’enregistrement numérique des signaux par chimiluminescence (Western digital). Récemment, un système automatisé de transfert western a été développé, à savoir le capillaire Ouest, qui est un système plus les mains libres et sans gel. Le test complet est automatique après le chargement d’une plaque d’échantillon (échantillons avec tous les réactifs nécessaires) dans le système3,4. L’instrument se produira toutes les étapes telles que la séparation de protéines, immobilisation des protéines sur la paroi capillaire, des incubations anticorps, lave entre les différentes étapes, de développement et quantification des signaux par chimiluminescence. Ainsi, la procédure de cIEF présentée ici fournit plus haut résolution et sensibilité.

Cette méthode est sensible, comme les signaux peuvent être générés et quantifiés de picogrammes de protéines1. La haute sensibilité avec excellente reproductibilité rend cette technologie très utile pour l’analyse des échantillons cliniques. Il peut détecter ainsi distinguer post traductionnelle modification (par exemple, les isoformes de protéines phosphorylées différents) des protéines. Cette technologie a été utilisée avec succès pour disséquer les différents signalisation voies4,5 études cliniques visant à développer de nouvelles thérapeutiques dans le cancer3, et il a un grand potentiel pour la protéine biomarqueur et découverte de médicaments .

Protocol

1. Culture, la Stimulation et la lyse des cellules Remarque : Cette méthode peut être utilisée avec plusieurs types de cellules. Pour illustrer la méthode, un exemple d’utilisation des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) est décrite. Culture des HUVECs sur gélatine-enduit, des plats de Pétri 10 cm dans le milieu basal des cellules endothéliales avec supplémentation appropriée (voir Table des matières) et contenant également 5 % …

Representative Results

Conception d’une nouvelle méthode de dosage : Une disposition de plaque dosage est illustrée dans la Figure 1 a. Au maximum, 96 puits peuvent être utilisés de la plaque 384 puits en blocs de 12 puits pour chaque maladie (anticorps). Chaque bloc de 12 puits peut commencer soit à partir de A1-A12 ou A13-A24. Lignes de code couleur permettent de distinguer des échantillons ou des réactifs de l’autre. Dans le modèle de test (<strong …

Discussion

Sensibilité et la résolution des protéines sont cruciales pour la recherche protéomique sur des échantillons biologiques. Il est une grande valeur à pouvoir détecter les protéines qui sont présentes en quantités infimes dans les cellules. cIEF peut offrir une sensibilité améliorée et la résolution pour la détection des protéines et leurs isoformes4.

Cette technologie a été utilisée avec succès dans plusieurs protéomiques recherche rapports<sup class…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

L’auteur remercie le Prof. Lena Claesson-Welsh, Université d’Uppsala, en Suède, pour son soutien pour l’élaboration de ce projet. En outre, l’auteur remercie Ross Smith et Lena Claesson-Welsh, Université d’Uppsala pour leur lecture critique et des suggestions pour améliorer le manuscrit.

Materials

NanoPro 1000 ProteinSimple
Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plug ProteinSimple 040-972 Ampholyte premix
DMSO inhibitor mix ProteinSimple 040-510 Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used
Aqueous Inhibitor Mix ProteinSimple 040-482 Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used
pI standard ladder 3 ProteinSimple 040-646 For cIEF 1:60 dilution used
Sample diluent ProteinSimple 040-649
Antibody diluent  ProteinSimple 040-309
Wash concentrate ProteinSimple 041-108
Anolyte Refill ProteinSimple 040-337
Catholyte Refill ProteinSimple 040-338
Peroxide XDR ProteinSimple 041-084
Luminol ProteinSimple 040-652
Bicine/CHAPS Lysis Buffer ProteinSimple 040-764
Capillaries-Charge Separation (1 pack) for  ProteinSimple CBS700
Assay Plate/Lid Kit ProteinSimple 040-663
Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)  Jackson ImmunoResearch  711-035-152 For cIEF used (1: 300)
Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)  Jackson ImmunoResearch  715-035-150 For cIEF used (1: 300)
Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody Cell Signaling 9101 For cIEF used (1: 50)
Pan Erk Primary Antibody Cell Signaling 9102 For cIEF used (1: 100)
Compass software ProteinSimple
HUVEC ATCC PCS-100-010
MV2 (EBM-2) PromoCell  C-22221 Endothelia cell basal medium
Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack PromoCell C-39221 Supplementation to MV2 above
VEGFA PeproTech 100-20
Long R3 IGF Sigma-Aldrich 85580C/I1146 Insulin-like growth factor
Bioruptor (Sonicator) Diagenode B01020001
BCA Protein Assay kit  Thermo Fischer Scientific 23225
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Thermo Fischer Scientific NP0322BOX
NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X) Thermo Fischer Scientific NP0001
NuPAGE Transfer Buffer (20X) Thermo Fischer Scientific NP0006
Immobilon PVDF membrane Millipore IPVH00010
Microfuge tube vortexer
Centrifuge
Microtiter plate adapter for centrifuge
Pipettors 
Tips
Ice

References

  1. O’Neill, R. A., et al. Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).
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Cite This Article
Padhan, N. Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method. J. Vis. Exp. (139), e56794, doi:10.3791/56794 (2018).

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