Обнаружение и удаление нуклеиназы загрязнения во время очистки рекомбинантных прототип пенистый вирус интеграза
Summary
Рекомбинантных прототип пенистый вирус интеграза белок часто бывает загрязнена бактериальной нуклеиназы во время очистки. Этот метод определяет нуклеиназы загрязнения и удаляет его из окончательной подготовки фермента.
Abstract
Интегразы (IN) белок ретровируса прототип пенистый вируса (PFV) является фермент модель для изучения механизма ретровирусной интеграции. По сравнению с в других ретровирусов, PFV в более растворимые и более пригодным для экспериментальных манипуляций. Дополнительно он чувствителен к ингибиторам в клинически значимых вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ-1), предполагая, что каталитического механизма в PFV похож на что из ВИЧ-1 дюйма в катализирует ковалентных присоединения вирусных комплементарной ДНК — (cDNA кДНК) целевой ДНК в процесс называется стренги передачи. Эта реакция передачи стренги вводит Никс ДНАО цели. Анализ интеграции продуктов реакции может быть confounded с присутствием nucleases, которые аналогичным образом Ник ДНК. Было показано, что бактериальные нуклеиназы совместно очищают с рекомбинантным PFV IN, выраженная в Escherichia coli (E. coli). Здесь мы описываем метод, чтобы изолировать в PFV от загрязняющих нуклеиназы хромотографией сродства гепарина. Фракций легко проверяются для нуклеиназы загрязнения с supercoiled плазмиды и электрофорез геля агарозы. PFV IN и загрязняющих нуклеиназы отображения альтернативных сходство для гепарина sepharose, позволяя нуклеиназы бесплатная подготовка рекомбинантных PFV в подходит для массового анализа биохимических или одной молекулы интеграции.
Introduction
Биохимические и одной молекулы исследования взаимодействий протеина с ДНК требуют исключительно чистым рекомбинантных белков. Заражение nucleases от бактерий может скрывать результаты этих анализов. Загрязняющие нуклеиназы были найдены в подготовке рекомбинантных белков кислород мусорщик protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) и прототип пенистый вирус (PFV) интегразы (IN) изолированы от Escherichia coli (E. coli)1 , 2 , 3.
Антиретровирусного лечения интеграции анализов полагаются на преобразование supercoiled ДНК одноцепочечным или линейные продукты как мера в деятельности4. Во время сотовой инфекции в присоединяется к два концы вирусный cDNA принимающей хроматина5. Каждый конец присоединения реакции называется стренги передачи. Анализы из рекомбинантных в деятельности могут вступать два ДНК олигомеров подражая вирусный cDNA заканчивается к целевому ДНК в согласованной интеграции реакции4,5,6,,7,8. В качестве альтернативы рекомбинантных в могут вступать только один конец ДНК в9,реакция-физиологически соответствующих половину сайта интеграции10. Когда supercoiled плазмида ДНК является целью интеграции, согласованной интеграции, которую продукты линеаризованных ДНК и половину сайта интеграции продукты расслабленной кругах. Эти продукты реакции идентифицируются по их относительной мобильностью во время электрофореза геля агарозы1. Если рекомбинантных в загрязняющих Нуклеаза, будет ложное расслабленной круги или возможно линеаризованного плазмида смешения экспериментальные результаты. Вирусной ДНК олигомеров может называться дневно окончательно определить интеграции продуктов, в отличие от нуклеиназы продуктов. Однако в значительной степени способствует supercoiled ДНК целей; любые потери supercoiled плазмиды расслабленной круги или линейной ДНК, загрязняющих нуклеиназы может исказить результаты и интерпретации данных11. Таким образом важно, чтобы удалить бактериальный nucleases из антиретровирусные препараты.
В PFV имеет различные сродство sepharose гепарина, по сравнению с бактериальным нуклеиназы1. PFV IN и нуклеиназы могут быть разделены линейного градиента элюирование с гепарином sepharose. Нуклеаза не обнаруживается легко ультрафиолетового (УФ) поглощения пика 280 Нм или аналитических натрия Додециловый сульфат электрофореза геля полиакриламида (SDS-PAGE). Вместо этого нуклеиназы обнаруживается нуклеиназы деятельности пробирного, используя преобразование supercoiled плазмид в расслабленной круги или линейные продукты. Каждая фракция после гепарина sepharose хроматографии проверяется на нуклеиназы деятельности. В PFV и загрязнителем нуклеиназы имеют никакой разницы в сродство для моно-Q анионообменных смол. Существует небольшая разница в сродство для моно-S катиона смолы. Однако моно-S резолюции бактериальных нуклеиназы и PFV в не позволит эффективное разделение белков. В конечном итоге очищение сродства sepharose гепарина предлагает лучшее разделение бактериальной нуклеиназы PFV в и имеет то преимущество, неограниченные загрузки тома.
Тестирование для загрязнения нуклеиназы активности могут быть адаптированы для других белков. Протеин интереса, вероятно, будет иметь альтернативные соответствия характеристик чем PFV IN; разница в обязательную силу характеристики протеина интереса и загрязняющими нуклеиназы должна определяться эмпирически. Эта методология для определения нуклеиназы загрязнения могут быть адаптированы к другим смолам, включая моно-S катион или моно-Q анионообменных смол. Аффинити и ионообменных смол может предложить надежный метод для изоляции рекомбинантных белков интересов от загрязнения nucleases без ограничений на объем белка во время хроматографии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Рекомбинатные протеины, которые взаимодействуют с ДНК, такие как ДНК ремонт белков, мусорщиков кислорода для одной молекулы микроскопии приложений, или антиретровирусного лечения integrases, должна быть свободна от заражения бактериальной nucleases2,3. Эти загря?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана низ AI099854 и AI126742 к ключу.
Materials
| BL21/DE3 Rosetta E. coli | EMD Millipore | 70956-4 | |
| LB broth | EMD biosciences | 1.10285.0500 | |
| Ampicillin | Amresco | 0339 | |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| IPTG | Denville Scientific | CI8280 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| PMSF | Amresco | 0754 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I0250 | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510 | |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Heparin Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0998-01 | |
| HRV14 3C protease | EMD Chemicals | 71493-3 |
References
- Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
- Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nat Methods. 12 (10), 901-902 (2015).
- Gunn, K. H., Marko, J. F., Mondragon, A. An orthogonal single-molecule experiment reveals multiple-attempt dynamics of type IA topoisomerases. Nat Struct Mol Biol. 24 (5), 484-490 (2017).
- Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. . Retroviruses. , (1997).
- Li, M., Craigie, R. Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration. J Biol Chem. 280 (32), 29334-29339 (2005).
- Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R., Craigie, R. Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates. EMBO J. 25 (6), 1295-1304 (2006).
- Sinha, S., Grandgenett, D. P. Recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase exhibits a capacity for full-site integration in vitro that is comparable to that of purified preintegration complexes from virus-infected cells. J Virol. 79 (13), 8208-8216 (2005).
- Goodarzi, G., Im, G. J., Brackmann, K., Grandgenett, D. Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase. J Virol. 69 (10), 6090-6097 (1995).
- Vora, A. C., Grandgenett, D. P. Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration. J Virol. 69 (12), 7483-7488 (1995).
- Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nat Commun. 7, 11409 (2016).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
