Rilevamento e rimozione di nucleasi contaminazione durante la purificazione del prototipo ricombinanti Virus schiumoso integrasi
Summary
Proteina di integrasi del virus schiumoso prototipo ricombinante è spesso contaminata con una nucleasi batterica durante la purificazione. Questo metodo identifica contaminazione nucleasi e lo rimuove dalla preparazione finale dell’enzima.
Abstract
La proteina di integrasi (IN) del virus schiumoso del prototipo di retrovirus (PFV) è un enzima di modello per studiare il meccanismo di integrazione retrovirale. Rispetto IN da altri retrovirus, PFV IN è più solubile e più suscettibili di manipolazione sperimentale. Inoltre, è sensibile a inibitori dell’IN clinicamente rilevanti virus di immunodeficenza umana (HIV-1), suggerendo che il meccanismo catalitico di PFV IN è simile a che di HIV-1 pollici pollici catalizza l’Unione covalente di virale DNA complementare (cDNA) per destinazione DNA in un processo chiamato trasferimento strand. Questa reazione di trasferimento del filo introduce Nick al DNA dell’obiettivo. Analisi dei prodotti di reazione di integrazione possono essere confuso dalla presenza di nucleasi quel nick allo stesso modo del DNA. Una nucleasi batterica è stata indicata per co-purificare con ricombinante IN PFV espressa in Escherichia coli (Escherichia coli). Qui descriviamo un metodo per isolare PFV IN dalla nucleasi contaminante dalla cromatografia di affinità di eparina. Le frazioni sono facilmente schermate per contaminazione di nucleasi con un plasmide supercoiled e l’elettroforesi del gel dell’agarosi. PFV IN e i contaminante nucleasi display alternativo affinità per eparina sepharose permettendo una preparazione nucleasi-free of recombinant PFV IN adatto per analisi biochimiche o singola molecola di massa di integrazione.
Introduction
Gli studi biochimici e singola molecola delle interazioni della proteina con DNA richiedono proteine ricombinanti eccezionalmente pure. Contaminando nucleasi da batteri possa oscurare i risultati di queste analisi. Una nucleasi contaminante è stata trovata in preparazioni a base di proteine ricombinanti ossigeno scavenger protocatecuato-3,4-diossigenasi (PCD) e prototipo virus schiumoso (PFV) integrasi (IN) isolato da Escherichia coli (Escherichia coli)1 , 2 , 3.
Integrazione retrovirale saggi si basano sulla conversione del DNA supercoiled ai prodotti intaccati o lineare come una misura di attività4. Durante l’infezione cellulare IN unisce le due estremità di un cDNA virale per l’host della cromatina5. Ogni estremità unendo la reazione è chiamato filo trasferimento. Saggi di ricombinante IN attività possono aderire due oligomeri del DNA che imita il cDNA virale termina ad un target di DNA in un’integrazione concertata reazione4,5,6,7,8. In alternativa IN ricombinante possono aderire solo un’estremità del DNA in un non-fisiologicamente rilevanti metà sito integrazione reazione9,10. Quando il DNA del plasmide supercoiled è la destinazione di integrazione, i prodotti sono concordate linearizzato DNA e mezza sito integrazione prodotti sono cerchi rilassati. Questi prodotti di reazione sono individuati dalla loro mobilità relativa nel corso di elettroforesi su gel di agarosio1. Se il ricombinante IN ha una nucleasi contaminante, ci saranno spurie cerchi rilassati o un plasmide linearizzato possibilmente confondendo i risultati sperimentali. Oligomeri del DNA virali possono essere etichettati fluorescente per identificare i prodotti di integrazione, al contrario di prodotti nuclease conclusivamente. Tuttavia, IN notevolmente favorisce target DNA supercoiled; qualsiasi perdita del plasmide supercoiled a cerchi rilassati o DNA lineare di contaminante nucleasi potrebbe inclinare risultati e interpretazione di dati11. Quindi è assolutamente necessario rimuovere nucleasi batteriche da retrovirali nelle preparazioni.
PFV IN ha una diversa affinità per l’eparina sepharose rispetto alla nucleasi batterica1. PFV IN e le nucleasi possono essere separati da un’eluizione di pendenza lineare da eparina sepharose. Le nucleasi non è rilevata prontamente da un’assorbanza di ultravioletti (UV) a 280 nm picco o di elettroforesi di analitica sodio dodecil solfato del gel di poliacrilammide (SDS-PAGE). Invece, la nucleasi viene rilevata da un’analisi di attività della nucleasi che impiegano la conversione di un plasmide supercoiled a cerchi rilassati o prodotti lineari. Ogni frazione seguendo cromatografia sepharose eparina è testato per attività della nucleasi. PFV IN e il contaminante nucleasi non hanno alcuna differenza nell’affinità per resina anionica Mono-Q. C’è una piccola differenza di affinità per resina del catione Mono-S. Tuttavia, la risoluzione di Mono-S di nucleasi batterica e PFV IN non consentirebbe efficiente separazione delle proteine. In definitiva, la purificazione di affinità di eparina sepharose offre la migliore separazione di nucleasi batterica da PFV IN e ha il vantaggio di volume di carico illimitato.
Test per attività della nucleasi di contaminanti possono essere adattati ad altre proteine. La proteina di interesse probabilmente avrà caratteristiche di affinità alternativi rispetto IN PFV; la differenza nelle caratteristiche della proteina di interesse e il contaminante di nucleasi di associazione deve essere determinata empiricamente. Questa metodologia per l’identificazione di contaminazione nucleasi può essere adattata a altre resine tra cui Mono-S catione o resine a scambio anionico Mono-Q. Affinità e scambio ionico resine possono offrire un metodo affidabile per isolare una proteina ricombinante di interesse da parte di contaminanti nucleasi senza limiti sul volume della proteina durante la cromatografia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Proteine ricombinanti che interagiscono con il DNA, come proteine, spazzini di ossigeno per le applicazioni di microscopia di singola molecola, o retrovirali integrases, di riparazione del DNA dovrebbero essere liberi di contaminanti batterici nucleasi2,3. Questi contaminanti possono confondere l’interpretazione dei risultati durante saggi biochimici o singola molecola alla rinfusa.
Abbiamo trovato che una nucleasi batterica frequentem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da NIH AI099854 e AI126742 a chiave.
Materials
| BL21/DE3 Rosetta E. coli | EMD Millipore | 70956-4 | |
| LB broth | EMD biosciences | 1.10285.0500 | |
| Ampicillin | Amresco | 0339 | |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| IPTG | Denville Scientific | CI8280 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| PMSF | Amresco | 0754 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I0250 | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510 | |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Heparin Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0998-01 | |
| HRV14 3C protease | EMD Chemicals | 71493-3 |
References
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