Summary

Heteromerik Protein Kompleksi-DNA Etkileşim Çalışmaları İçin Modifiye Maya-Bir Hibrid Sistem

Published: July 24, 2017
doi:

Summary

Burada açıklanan tadil edilmiş maya tek hibrid tahlil, herhangi bir işlevsel genomik çalışma için heterolog bir sistemde heteromerik protein kompleksi-DNA etkileşimini incelemek ve doğrulamak için klasik maya tek hibrid (Y1H) analizinin bir uzantısıdır.

Abstract

Yıllar boyunca, maya tek hibrid tahlili, transkripsiyon faktörleri (TF'ler) ve DNA hedefleri gibi proteinler arasındaki fiziksel etkileşimleri tanımlamak ve doğrulamak için önemli bir teknik olduğu kanıtlanmıştır. Burada sunulan yöntem Y1H'nin altında yatan kavramı kullanır, ancak hedef DNA'sına bağlanan protein komplekslerini incelemek ve doğrulamak için daha da modifiye edilir. Bu nedenle modifiye edilmiş maya tek hibrid (Y1.5H) tahlili olarak geçmektedir. Bu test maliyet açısından etkili olup, düzenli bir laboratuar ortamında kolayca uygulanabilir. Her ne kadar heterolog bir sistem kullansa da , tarif edilen yöntem, herhangi bir çalışma sisteminde, özellikle bitki genomiği için işlevsel genomik için DNA hedeflerine / hücrelerine bağlanan heteromerik protein kompleksini test etmek ve doğrulamak için değerli bir araç olabilir.

Introduction

Genel olarak, protein-DNA etkileşimlerini anlamak için Y1H tahlili, laboratuar ortamında başarıyla kullanılan tercih edilen sistemdir 1 . Temel Y1H tahlili iki bileşen içerir: a) bir raportör proteini şifreleyen bir genin üst akışına başarıyla klonlanmış ilgi DNA'sı olan bir raportör yapı; Ve b) ilgili TF ile bir maya transkripsiyon aktivasyon alanı (AD) arasında bir füzyon proteini üretecek bir ifade konstrüksiyonu. Fusion protein "av" olarak bilinirken ilgi DNA, yaygın olarak 'yem' olarak anılır. Geçmiş yıllarda, Y1H tahlilinin birden fazla versiyonu, kendi avantajları ile spesifik ihtiyaçlara göre geliştirilmiştir 2 . Mevcut Y1H tahlili, DNA yemiyle bir defada bir proteinin etkileşimini tanımlamak ve doğrulamak için başarılı bir şekilde uygulanabilir ancak heterodimerik veya multimerik protein-DNA etkileşimlerini tanımlama yeteneğinden yoksundur.

"> Burada açıklanan yöntem, mevcut Y1H'nin değiştirilmiş bir versiyonudur ve araştırmacıların hedef DNA dizilimine / proteinlerine aynı anda birden çok protein bağlamalarını sağlar Bu tahlilin amacı, bir etkinleştirme domeniyle ilgilenilen proteini (pDEST22: TF) ve maya sisteminde etkileşen protein partnerinin (pDEST32ΔDBD-TF) varlığında ve / veya yokluğunda bir haberci ile birleştirilen aday DNA bölgelerinin aktivasyonunu değerlendirin.Bu tahlilde bu iki Proteinlerin, hedefin aktivasyonu için gereklidir.Bu, bir GATEWAY klonlama uyumlu sistemidir ve bu nedenle, düzenli bir laboratuar ortamında kullanılmak üzere uygundur.Bu protokol, bir maya sistemindeki farklı TF'lerin birlikte dönüştürülmesini kolaylaştıran doğrudan dönüşüme dayanır Dolayısıyla, in vitro moleküler ve fonksiyonel doğrulama için olası DNA hedeflerine bağlanan protein komplekslerini doğrulamak için avantajlı bir strateji fVeya herhangi bir sistem. Tandem afiniteli saflaştırma (TAP) yöntemleri gibi mevcut teknikler maliyetli ve emek gerektirir, ancak protein hetro-komplekslerinin büyük ölçekte saptanmasına izin verir 3 , 4 , 5 . Bu modifiye maya tek hibridi, küçük bir ölçekte ( Şekil 1 ) düzenli bir laboratuar ortamında başarıyla uygulanabilir ve aynı zamanda maliyet açısından da etkili olur. Y1.5H tahlili, heterolog bir sistem kullanarak ortak bir DNA hedefine bağlanan multimerik protein kompleksinin rolünü tanımlamaya yönelik hipotezlerini test etmek ve doğrulamak için toplumdaki araştırmacıları kolaylaştırabilir. Bulgulara dayanarak, hipotez, tercih edilen çalışma sisteminde in vivo olarak doğrulanabilir. Son zamanlarda, Arabidopsis 6'da çiçek açmayı düzenleyen bir TF'nin rolünü ve bunun hareket biçimini tanımlamak için bu yaklaşımı kullandık.

Protocol

1. Yapılandırma ve Reporter Plazmid Hazırlama PCR, E. coli (TOP10) kullanılarak giriş vektörüne klonlama için analiz edilecek hedef DNA'nın "fragmanları" (tercihen ~ 250-500 bp) promoter bölgelerini çoğaltır. Sekans teyitinin ardından, 8 , 9 , 10 , 11'de tarif edildiği gibi pozitif klonun uyumlu bir pGLacZi ekspresyon vektö…

Representative Results

İlgilenen protein ile maya hücrelerindeki DNA bölgelerinin birlikte dönüştürülmesi için genel plaka hazırlama prosedürü ( Şekil 2 ). Plaka düzeneği, deneye ve test edilen DNA bölgeleri / fragmanlarının sayısına göre değiştirilebilir. Protokolün 5. gününden sonra, iyi yetiştirilmiş ve pozitif bir plaka Şekil 3'deki gibi görünmelidir. Çalışmamızda, transkripsiyon başlangıç ​​alanının…

Discussion

Mevcut Y1H standart prosedürü, DNA yemine bağlanan tek bir protein yırtıcıyı tanımlamak için uygundur. Çeşitli teknik değişikliklerle, mevcut sistem transkripsiyonel düzenleyici ağları tanımlamak için kullanılmıştır. Bununla birlikte, TF'lerin, iki veya daha fazla TF veya protein içeren komplekslerin bir parçası olarak işlev gördüğü ve bunların sadece bir kısmının DNA'ya bağlanabildiği bilinmektedir. Sadece protein bağlama alanlarına sahip olan ve DNA'ya bağlanma yetene…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazının eleştirel okunması için SS Wang, M. Amar ve A. Galla'ya teşekkür ediyoruz. Bu yayında bildirilen araştırmalar Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Tıp Bilimleri Enstitüsü tarafından RO1GM067837 ve RO1GM056006 (SAK'a) ödül numaraları ile desteklenmiştir. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmez.

Materials

pDEST22 vector Invitrogen PQ1000101 Pro-Quest Two hybrid system kit
pDEST32delatDBD Invitrogen PQ1000102 Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain
pENTR/D-TOPO Cloning Kit Invitrogen K240020
YM4271 Strain Clontech K1603-1 MATCHMAKER One-Hybrid System
pEXP-AD502 Invitrogen PQ1000101 Pro-Quest Two hybrid system kit
GATEWAY LR Clonase II enzyme mix Invitrogen 11791020
YPDA media Clontech 630410
SD-Agar Clontech 630412
SD minimal media Clontech 630411
Uracil DO Supplement Clontech 630416
Tryptophan Do Supplement Clontech 630413
Tris Base Fisher Scientific BP152-1
EDTA Fisher Scientific S311-500
LiAc Sigma-Aldrich L4158
Saplmon Sperm (10mg/ml) Invitrogen 15632011
96 well round bottom Plate Greiner bio-one 650101
PEG3350 Sigma-Aldrich 1546547
96-deep well block USA Scientific 1896-2000
Sealable Foil USA Scientific 2923-0110
Araseal Excel Scientific B-100
2-mercaptoethanol Fisher Scientific 034461-100
ONPG Sigma-Aldrich 73660
Na2CO3 Sigma-Aldrich 223484
Na2HPO4  Sigma-Aldrich S3264
NaH2PO4  Sigma-Aldrich S3139
KCL Fisher Scientific BP366-500
MgSO4  Sigma-Aldrich 83266
HCL Fisher Scientific SA54-4
Drybath Thermo Fischer
Voretx Thermo Fischer
Centrifgue Eppendorf Centrifuge 5810R
Plate Reader Molecular Device SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer
Incubator Thermo Fisher Model No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees
Shaker Incubator New Brunswick
Water Bath Thermo Fisher IsoTemp 205
Puncher
50 ml Falocn BD Falcon
Beaker Nalgene
Flask Nalgene
Petriplates (150mm) Greiner bio-one

References

  1. Saghbini, M., Hoekstra, D., Gautsch, J. Media formulations for various two-hybrid systems. Methods Mol Biol. 177, 15-39 (2001).
  2. Reece-Hoyes, J. S., Marian Walhout, A. J. Yeast one-hybrid assays: A historical and technical perspective. Methods. 57 (4), 441-447 (2012).
  3. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
  4. Puig, O., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
  5. Gavin, A. -. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
  6. Tripathi, P., Carvallo, M., Hamilton, E. E., Preuss, S., Kay, S. A. Arabidopsis B-BOX32 interacts with CONSTANS-LIKE3 to regulate flowering. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (1), 172-177 (2017).
  7. Helfer, A., et al. LUX ARRHYTHMO encodes a nighttime repressor of circadian gene expression in the Arabidopsis core clock. Curr Biol : CB. 21 (2), 126-133 (2011).
  8. Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Rep. 8 (2), 622-632 (2014).
  9. Wanke, D., Harter, K. Analysis of Plant Regulatory DNA sequences by the Yeast-One-Hybrid Assay. Methods Mol Biol. 479, 291-309 (2009).
  10. Klein, P., Dietz, K. -. J. Identification of DNA-Binding Proteins and Protein-Protein Interactions by Yeast One-Hybrid and Yeast Two-Hybrid Screen. Methods Mol Biol. 639, 171-192 (2010).
  11. Breton, G., Kay, S. A., Pruneda-Paz, J. L. Identification of Arabidopsis Transcriptional Regulators by Yeast One-Hybrid Screens Using a Transcription Factor ORFeome. Methods Mol Biol. 1398, 107-118 (2016).
  12. Deplancke, B., Vermeirssen, V., Arda, H. E., Martinez, N. J., Walhout, A. J. M. Gateway-Compatible Yeast One-Hybrid Screens. CSH Protoc. 2006 (5), (2006).
  13. Deplancke, B., Dupuy, D., Vidal, M., Walhout, A. J. M. A gateway-compatible yeast one-hybrid system. Genome Res. 14 (10B), 2093-2101 (2004).

Play Video

Cite This Article
Tripathi, P., Pruneda-Paz, J. L., Kay, S. A. A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies. J. Vis. Exp. (125), e56080, doi:10.3791/56080 (2017).

View Video