Summary

A השתנה- Hybrid מערכת אחת עבור חלבון Heteromeric מורכבות- DNA אינטראקציה מחקרים

Published: July 24, 2017
doi:

Summary

שמרים שונה אחד assay היברידית שתוארו כאן היא הרחבה של שמרים קלאסיים אחד היברידית (Y1H) assay ללמוד ולאמת את האינטראקציה מורכבים חלבון ה- DNA heteromeric במערכת heterologous עבור כל מחקר גנומי פונקציונלי.

Abstract

במהלך השנים, השמרים assay אחת היברידית הוכיחה להיות טכניקה חשובה לזיהוי ואימות של אינטראקציות פיזיות בין חלבונים כגון גורמי שעתוק (TFs) ואת יעד ה- DNA שלהם. השיטה המוצגת כאן מנצל את המושג הבסיסי של Y1H אבל הוא שונה עוד יותר ללמוד ולאמת מתחמי חלבון מחייב את ה- DNA היעד שלהם. לפיכך, הוא מכונה שמרים שונה אחד היברידית (Y1.5H) assay. Assay זה הוא חסכוני וניתן לבצע בקלות במסגרת מעבדה רגילה. אם כי באמצעות מערכת heterologous, השיטה המתוארת יכול להיות כלי רב ערך כדי לבדוק ולאמת את החלבון heteromeric מורכבים מחייב יעד ה- DNA שלהם (ים) עבור גנומיקה תפקודית בכל מערכת של מחקר, במיוחד גנומיקה הצמח.

Introduction

באופן כללי, כדי להבין אינטראקציות DNA- חלבון, assay Y1H היא המערכת המועדפת בהצלחה בשימוש במעבדה הגדרה 1 . Assay בסיסי Y1H כוללת שני מרכיבים: א) כתב עם דנ"א של עניין בהצלחה משובטים במעלה הזרם של הגן קידוד חלבון הכתב; ו – ב) ביטוי ביטוי אשר יפיק חלבון היתוך בין TF של עניין ושדה ההפעלה שעתוק שעתוק (AD). ה- DNA של עניין הוא נפוץ המכונה "פתיון" בעוד חלבון היתוך המכונה "טרף". בשנים האחרונות, גרסאות מרובות של assay Y1H פותחו כדי להתאים לצרכים ספציפיים עם היתרונות שלהם 2 . Assay Y1H הקיים יכול להיות מיושם בהצלחה לזהות ולאמת אינטראקציה של חלבון אחד בכל פעם עם הפיתיון DNA שלה, אבל חסר את היכולת לזהות אינטראקציות DNA חלבון heterodimeric או multimeric.

"השיטה המתוארת כאן היא גרסה שונה של Y1H הקיים החוקרים המאפשרים בו זמנית ללמוד חלבונים מרובים המחייבים את רצף ה- DNA שלהם היעד.המטרה של assay זה היא לבטא את החלבון של עניין עם תחום ההפעלה (pDEST22: TF) ולהעריך את ההפעלה של אזורי ה- DNA המועמד התמזגו לכתב בנוכחות ו / או היעדרות של שותף חלבון אינטראקציה (pDEST32ΔDBD-TF) במערכת שמרים.ה assay זה יאפשר לנו לקבוע אם האינטראקציה בין שני אלה חלבונים נדרשים להפעלת המטרה.זו מערכת תואמת שיבוט GATEWAY ולכן ניתן להשתמש בהגדרת מעבדה רגילה.זה מבוסס על שינוי ישיר, אשר מספק את הקלות של שיתוף טרנספורמציה של TFs שונים במערכת שמרים לכן, זוהי אסטרטגיה יתרון כדי לאמת את מתחמי חלבון מחייב את מטרות DNA אפשרי שלהם במבחנה מולקולרית ופונקציונלית אימות Fאו כל מערכת. טכניקות הנוכחי כגון טנדם זיקה טיהור (TAP) שיטות יקרים ועבודה אינטנסיבית, אך מאפשרים זיהוי של hetrocomplexes חלבון בקנה מידה גדול 3 , 4 , 5 . זה שונה שמרים אחד היברידית ניתן לבצע בהצלחה במסגרת מעבדה רגילה בקנה מידה קטן ( איור 1 ) והוא גם חסכוני. Assay Y1.5H יכול להקל על חוקרים ברחבי הקהילה לבדוק ולאמת את ההשערה שלהם לקראת הגדרת תפקידו של חלבון רב מחייב מורכבים היעד DNA משותף באמצעות מערכת heterologous. בהתבסס על הממצאים, ההשערה יכולה להיות מאומתת ב- vivo במערכת המחקר המועדפת. לאחרונה, השתמשנו בגישה זו כדי להגדיר את תפקידו של TF ואת אופן הפעולה שלה כדי להסדיר פריחה ב Arabidopsis 6 .

Protocol

1. בניית וכתב פלסמיד ההכנה PCR להגביר את אזורי האמרגן / "שברי" (רצוי ~ 250 – 500 BP) של ה- DNA היעד להיות מנותח עבור שיבוט נוסף לתוך וקטור כניסה באמצעות E. coli (TOP10). עם אישור רצף, subclone שיבוט חיו?…

Representative Results

הצלחת הכללית הגדרת הליך עבור שיתוף טרנספורמציה של אזורי ה- DNA בתאים שמרים עם חלבון של עניין ( איור 2 ). הצלחת הגדרת יכול להיות שונה בהתאם לצורך של הניסוי ומספר אזורי DNA / שברי נבדק. לאחר יום 5 של פרוטוקול צלחת טובה מבוגר חיובי צריך להיות ג?…

Discussion

ההליך הסטנדרטי הקיים של Y1H מתאים לזיהוי טרף חלבון בודד המחייב את הפיתיון הדנ"א שלו. עם שינויים טכניים שונים, המערכת הקיימת כבר רתמה להגדרת רשתות רגולטוריות תמלוליות. עם זאת, TFs ידועים לתפקד כחלק ממכלול מורכב של שניים או יותר TFs או חלבונים, עם רק חלק TF מסוגל לחייב את ה- …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לס"ס ואנג, מ 'עמר וא' גאלה לקריאה ביקורתית של כתב היד. מחקר שפורסם בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספרי פרסים RO1GM067837 ו RO1GM056006 (כדי SAK). התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

Materials

pDEST22 vector Invitrogen PQ1000101 Pro-Quest Two hybrid system kit
pDEST32delatDBD Invitrogen PQ1000102 Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain
pENTR/D-TOPO Cloning Kit Invitrogen K240020
YM4271 Strain Clontech K1603-1 MATCHMAKER One-Hybrid System
pEXP-AD502 Invitrogen PQ1000101 Pro-Quest Two hybrid system kit
GATEWAY LR Clonase II enzyme mix Invitrogen 11791020
YPDA media Clontech 630410
SD-Agar Clontech 630412
SD minimal media Clontech 630411
Uracil DO Supplement Clontech 630416
Tryptophan Do Supplement Clontech 630413
Tris Base Fisher Scientific BP152-1
EDTA Fisher Scientific S311-500
LiAc Sigma-Aldrich L4158
Saplmon Sperm (10mg/ml) Invitrogen 15632011
96 well round bottom Plate Greiner bio-one 650101
PEG3350 Sigma-Aldrich 1546547
96-deep well block USA Scientific 1896-2000
Sealable Foil USA Scientific 2923-0110
Araseal Excel Scientific B-100
2-mercaptoethanol Fisher Scientific 034461-100
ONPG Sigma-Aldrich 73660
Na2CO3 Sigma-Aldrich 223484
Na2HPO4  Sigma-Aldrich S3264
NaH2PO4  Sigma-Aldrich S3139
KCL Fisher Scientific BP366-500
MgSO4  Sigma-Aldrich 83266
HCL Fisher Scientific SA54-4
Drybath Thermo Fischer
Voretx Thermo Fischer
Centrifgue Eppendorf Centrifuge 5810R
Plate Reader Molecular Device SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer
Incubator Thermo Fisher Model No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees
Shaker Incubator New Brunswick
Water Bath Thermo Fisher IsoTemp 205
Puncher
50 ml Falocn BD Falcon
Beaker Nalgene
Flask Nalgene
Petriplates (150mm) Greiner bio-one

References

  1. Saghbini, M., Hoekstra, D., Gautsch, J. Media formulations for various two-hybrid systems. Methods Mol Biol. 177, 15-39 (2001).
  2. Reece-Hoyes, J. S., Marian Walhout, A. J. Yeast one-hybrid assays: A historical and technical perspective. Methods. 57 (4), 441-447 (2012).
  3. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
  4. Puig, O., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
  5. Gavin, A. -. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
  6. Tripathi, P., Carvallo, M., Hamilton, E. E., Preuss, S., Kay, S. A. Arabidopsis B-BOX32 interacts with CONSTANS-LIKE3 to regulate flowering. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (1), 172-177 (2017).
  7. Helfer, A., et al. LUX ARRHYTHMO encodes a nighttime repressor of circadian gene expression in the Arabidopsis core clock. Curr Biol : CB. 21 (2), 126-133 (2011).
  8. Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Rep. 8 (2), 622-632 (2014).
  9. Wanke, D., Harter, K. Analysis of Plant Regulatory DNA sequences by the Yeast-One-Hybrid Assay. Methods Mol Biol. 479, 291-309 (2009).
  10. Klein, P., Dietz, K. -. J. Identification of DNA-Binding Proteins and Protein-Protein Interactions by Yeast One-Hybrid and Yeast Two-Hybrid Screen. Methods Mol Biol. 639, 171-192 (2010).
  11. Breton, G., Kay, S. A., Pruneda-Paz, J. L. Identification of Arabidopsis Transcriptional Regulators by Yeast One-Hybrid Screens Using a Transcription Factor ORFeome. Methods Mol Biol. 1398, 107-118 (2016).
  12. Deplancke, B., Vermeirssen, V., Arda, H. E., Martinez, N. J., Walhout, A. J. M. Gateway-Compatible Yeast One-Hybrid Screens. CSH Protoc. 2006 (5), (2006).
  13. Deplancke, B., Dupuy, D., Vidal, M., Walhout, A. J. M. A gateway-compatible yeast one-hybrid system. Genome Res. 14 (10B), 2093-2101 (2004).

Play Video

Cite This Article
Tripathi, P., Pruneda-Paz, J. L., Kay, S. A. A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies. J. Vis. Exp. (125), e56080, doi:10.3791/56080 (2017).

View Video