En iyi kromozom Location(s) belirlenmesi için yeni bir Transposon-aracılı yaklaşımın kullanarak Escherichia coli DNA öğesinde
Summary
Burada, bir transposon-aracılı rasgele ekleme kodlamayan DNA öğesinin gücünü en iyi kromozom konumunu gidermek için kullanıldı.
Abstract
Belirli bir DNA öğeyi en iyi kromozom pozisyon(lar)/rasgele ekleme transposon-aracılı fitness seçime göre takip tarafından belirlendi. Bakterilerde genetik bir öğe işlev genetik içeriğine etkisini değerlendirmek zor olabilir. Topolojik etkileri, komşu genler ve/veya çoğaltma ilişkili gen dozaj, transkripsiyon müdahalelerden de dahil olmak üzere çeşitli mekanizmalar belirli bir genetik öğeyi işlevini etkileyebilir. Burada, kromozom Escherichia coli ve basit büyüme rekabet kullanarak en uygun konumları deneme Seç rasgele entegrasyonu, bir DNA öğesi izin veren bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntem rasgele ekleme, büyüme avantajı, deneysel ihtiyaçlarına kolayca ayarlanabilir bir yordam tarafından fittest clone(s) bir seçim ile birleştiğinde iyi tarif bir transposon tabanlı sistem yararlanır. Fittest clone(s) doğası karmaşık bir çok klonal nüfusun bütün-genom sıralama veya seçili klonlar hızlı tanımlanması için yürüyüş kolay gen tarafından belirlenebilir. Burada, kodlamayan DNA bölge E. colikromozom çoğaltması başlatma kontrol, DARS2, örnek olarak kullanılmıştır. DARS2 fonksiyonu çoğaltma ilişkili gen dozaj tarafından etkilendiği bilinmektedir; daha yakın DARS2 DNA ikileşmesi, kökeni daha etkin hale gelir alır. DARS2 rasgele bir DARS2kromozom eklenen-zorlanma silinmiş. Bireysel eklemeler içeren sonuç klonlar havuza alınmış ve birbirlerine karşı yüzlerce nesiller için yarıştı. Son olarak, fittest klonlar ile karakterize ve yakın özgün DARS2 konumuna eklenen DARS2 içerecek şekilde bulundu.
Introduction
Genetik herhangi bir öğe işlev genom konumunda etkilenebilir. Bakterilerde bu esas olarak müdahalelerden komşu genler, yerel DNA topoloji ve/veya çoğaltma ilişkili gen dozaj transkripsiyon tarafından neden olur. Özellikle, DNA ikileşmesi ve segregasyon süreçleri, en azından bölümünde kontrol edilir, kromozom bölgeleri kodlamayan1ve bu bölgeler düzgün genomik konumu/içeriğine bağlıdır. E.coliiçinde kardeşi için gerekli DIF site örnekler kromozom çözüm2; Kromozom segregasyon3için gereken KOPS serilerini; ve veri, DARS1ve DARS2 bölgeleri, uygun kromozom çoğaltma denetimi (aşağıda; için gerekli 4). biz izin rasgele tehcir, seçim ve genetik verilen herhangi bir öğe, en uygun genetik bağlamında belirlenmesi için örneği burada kodlamayan DARS2 bölgesinin çalışma odasına bir yöntem mevcut.
E. coli, DnaA başlatıcı protein DNA dizisi tek çoğaltma kökenoriCaçılış ve helikaz DnaB5,6,7alımı sorumludur. AAA+ (Yani, çeşitli aktiviteler ile ilişkili ATPases) kime ait DnaA proteinler ve ATP ve ADP ile benzer yüksek bağlayabilirsiniz benzeşim5. DnaAATP düzeyini doruklarına başlatma8nerede DnaAATP oluşturan bir multimer üzerinde oriC DNA çift yönlü açılış9tetikler. Başlatma sonra oriC bağlama hemimethylated için SeqA protein içeren bir mekanizma geçici olarak kullanım dışı haciz nedeniyle yeniden başlatma için yapılır oriC10,11. Haciz sırasında en az iki mekanizma ile DnaAATP düzeyi azalır: DnaA (RIDA)12,13 ve veridüzenleme inactivation-bağımlı DnaAATP hidroliz (DDAH)14 ,15. RIDA ve DDAH DnaAATP dönüştürmeye DnaAADPtanıtmak. Önce yeni bir tur başlatma DnaAADP DnaAATP belirli DnaA yeniden etkinleştirme dizileri (DARS) yeniden aktif: DARS1 ve DARS216,17. Kromozom veri, DARS1ve DARS2 bölgeleri kodlamayan ve hareket DnaAATPmodüle için bir refakatçi benzeri şekilde /DnaAADP şekilde. Çoğaltma, kökeni dışında yer alan bu bölgeler, karmaşık bir DnaA Meclisi etkinleştirmek için de inactivation (veri; 14) ya da harekete geçirmek (DARS1 ve DARS2; 17), DnaA. DARS2 hücrede silme kitle katlama zaman ama sonuçları zaman uyumsuz çoğaltma başlatma15,16,18değiştirmez. Ancak, DARS2-eksik hücrelerin bir fitness var aksi halde isogenic bir wildtype için her iki sürekli büyüme rekabet zengin Orta veya fare bağırsak18kolonizasyon kurulması sırasında karşılaştırıldığında maliyet. Bu eşzamansız/kökenli konsantrasyon bile küçük değişiklikler bakteriyel fitness üzerinde olumsuz bir etkisi gösterir. E. coli, kromozom simetri (Yani, iki neredeyse eşit uzunlukta çoğaltma kol)19korumak için seçici bir basınç vardır. Veri, DARS1ve DARS2 bölgeleri aynı göreli uzaklık var oriC içinde tüm E. coli suşları18, kromozom boyutu büyük değişimler rağmen sıralı.
Burada, kromozom pozisyon(lar) için işlevini en iyi tanımlanması için bir örnek olarak E. coli DARS2 bölge kullanırız. DARS2 NKBOR transposon ve sonuç NKBOR içine eklenen:: daha sonra rastgele MG1655 genom eklenenDARS2 transposon ΔDARS2. Böylece hücre koleksiyonu üretilen, kromozom üzerinde farklı bir yerde her sahip DARS2 yerleştirilir. Nerede koleksiyondaki tüm hücreleri havuza alınmış ve birbirlerine karşı sırasında LB sürekli büyüme tahmini 700 nesiller için yarıştı, vitro rekabet deney, gerçekleştirildi. Rekabet denemenin sonucu izlenen/Southern blot, kolay gen yürüyüş ve bütün-genom sıralama (WGS; kullanarak tespit edildi Şekil 1). Kolay gen yürüyerek çözüldü son nokta klonlar hücre döngüsü parametreleri değerlendirmek için Akış Sitometresi tarafından karakterize. Bir akış sitometrik analizinde çok sayıda hücre için hücre boyutu, DNA içeriği ve inisiyasyon senkronizasyonu ölçülebilir. Akış Sitometresi sırasında bir akış tek hücre sonra aynı anda verilmiş Floresans DNA içeriği, bir ölçü birimi toplamak photomultipliers tarafından sağlanan kayıtlı lekeli DNA heyecanlandırmak için uygun dalga boyu bir ışık huzmesi geçer. hücreleri DNA için lekeli. İleri dağınık ışık hücre kitle20ölçüsüdür.
Burada mevcut vitro rekabet deney kromozom pozisyon ve genomik genetik öğesi bağlamında önemi ile ilgili soruları gidermek için kullanılır. Tarafsız ve kolay yöntemdir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada kullanılan metodoloji ile ilgili genetik bir öğenin en uygun genomik konumunu zor bir soruyu cevaplamak için state-of–art teknikleri yararlanır. (Transposon tarafından aracılı) genetik öğesi rasgele yerleştirilmesi için incelenen genetik öğesinin konumu en iyi seçmek için birbirlerine karşı rekabet yapılabilir klonlar binlerce hızlı ve kolay toplama sağlar (Yani fittest klon).
Burada, DARS2 mini-Tn10eklenmiş-transposon, NKBOR dayalı. T…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Novo Nordisk Vakfı, Lundbeck Vakfı ve Danimarka Ulusal Araştırma Vakfı (DNRF120) Merkezi aracılığıyla gelen hibe tarafından bakteriyel stres tepkisi ve sebat (BASP) için finanse edilmiştir.
Materials
| Autoclaved Mili-Q water | None | ||
| Electroporation Cuvettes, 0.1 cm | Thermo Fisher Scientific | P41050 | |
| Bio-Rad MicroPulser Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780029 | |
| LB Agar, powder (Lennox L agar) | Thermo Fisher Scientific | 22700025 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 17904 | |
| Fisherbrand Plastic Petri Dishes | Fisher Scientific | S33580A | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7634 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| dATP, [α-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 µCi | PerkinElmer | BLU012H250UC | |
| DECAprime II DNA Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1455 | |
| Spectrophotometer SF/MBV/03.32 | Pharmacia | ||
| Hermle Centrifuge SF/MBV/03.46 | Hermle | ||
| Ole Dich Centrifuge SF/MBV/03.29 | Ole Dich | ||
| Eppendorftubes 1.5 mL | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| Eppendorftubes 2.0 mL | Sigma-Aldrich | T2795 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| 96% Ethanol | Sigma-Aldrich | 16368 | |
| Trizma HCl | Sigma-Aldrich | T-3253 | |
| Phenol Ultra Pure | BRL | 5509UA | |
| Chloroform | Merck | 2445 | |
| Ribonuclease A type II A | Sigma-Aldrich | R5000 | |
| Sodiumdodecylsulphate (SDS) | Merck | 13760 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L 6876 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 405-7 | |
| 0.5M Na-EDTA pH 8.0 | BRL | 5575 UA | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 10106801001 | |
| PvuI (10 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | ER0621 | |
| UltraPure Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500500 | |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 433160 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 71687 | |
| Whatman 3MM papers | Sigma-Aldrich | WHA3030931 | |
| SSC Buffer 20× Concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| Amersham Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN119B | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F8016 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
| Bovine Serum Albumin – Fraction V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| Carestream Kodak BioMax light film | Sigma-Aldrich | Z373494 | |
| GenElute Gel Extraction Kit | Sigma-Aldrich | NA1111 | |
| GenElute PCR Clean-Up Kit | Sigma-Aldrich | NA1020 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | ||
| Rifampicin | Serva | 34514.01 | |
| Cephalexin | Sigma-Aldrich | C4895 | |
| Mithramycin | Serva | 29803.02 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 246964 | |
| Apogee A10 instrument | Apogee |
References
- Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Lobner-Olesen, A. Control of bacterial chromosome replication by non-coding regions outside the origin. Curr Genet. , (2016).
- Sherratt, D. J., et al. Recombination and chromosome segregation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 359 (1441), 61-69 (2004).
- Bigot, S., et al. DNA motifs that control E. coli chromosome segregation by orienting the FtsK translocase. EMBO J. 24 (21), 3770-3780 (2005).
- Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. DNA Replication Control Is Linked to Genomic Positioning of Control Regions in Escherichia coli. PLoS Genet. 12 (9), 1006286 (2016).
- Kornberg, A., Baker, T. A. . DNA Replication, Second Edition. , (1992).
- Kaguni, J. M. Replication initiation at the Escherichia coli chromosomal origin. Curr Opin Chem Biol. 15 (5), 606-613 (2011).
- Leonard, A. C., Grimwade, J. E. Regulation of DnaA assembly and activity: taking directions from the genome. Annu Rev Microbiol. 65, 19-35 (2011).
- Kurokawa, K., Nishida, S., Emoto, A., Sekimizu, K., Katayama, T. Replication cycle-coordinated change of the adenine nucleotide-bound forms of DnaA protein in Escherichia coli. EMBO J. 18 (23), 6642-6652 (1999).
- Sekimizu, K., Bramhill, D., Kornberg, A. ATP activates dnaA protein in initiating replication of plasmids bearing the origin of the E. coli chromosome. Cell. 50 (2), 259-265 (1987).
- Brendler, T., Austin, S. Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences. EMBO J. 18 (8), 2304-2310 (1999).
- Lu, M., Campbell, J. L., Boye, E., Kleckner, N. SeqA: a negative modulator of replication initiation in E. coli. Cell. 77 (3), 413-426 (1994).
- Katayama, T., Kubota, T., Kurokawa, K., Crooke, E., Sekimizu, K. The initiator function of DnaA protein is negatively regulated by the sliding clamp of the E. coli chromosomal replicase. Cell. 94 (1), 61-71 (1998).
- Kato, J., Katayama, T. Hda, a novel DnaA-related protein, regulates the replication cycle in Escherichia coli. EMBO J. 20 (15), 4253-4262 (2001).
- Kasho, K., Katayama, T. DnaA binding locus datA promotes DnaA-ATP hydrolysis to enable cell cycle-coordinated replication initiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 936-941 (2013).
- Kitagawa, R., Ozaki, T., Moriya, S., Ogawa, T. Negative control of replication initiation by a novel chromosomal locus exhibiting exceptional affinity for Escherichia coli DnaA protein. Genes Dev. 12 (19), 3032-3043 (1998).
- Fujimitsu, K., Senriuchi, T., Katayama, T. Specific genomic sequences of E. coli promote replicational initiation by directly reactivating ADP-DnaA. Genes Dev. 23 (10), 1221-1233 (2009).
- Kasho, K., Fujimitsu, K., Matoba, T., Oshima, T., Katayama, T. Timely binding of IHF and Fis to DARS2 regulates ATP-DnaA production and replication initiation. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13134-13149 (2014).
- Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. Control regions for chromosome replication are conserved with respect to sequence and location among Escherichia coli strains. Front Microbiol. 6, 1011 (2015).
- Bergthorsson, U., Ochman, H. Distribution of chromosome length variation in natural isolates of Escherichia coli. Mol Biol Evol. 15 (1), 6-16 (1998).
- Boye, E., Steen, H. B., Skarstad, K. Flow cytometry of bacteria: a promising tool in experimental and clinical microbiology. J Gen Microbiol. 129 (4), 973-980 (1983).
- Rossignol, M., Basset, A., Espeli, O., Boccard, F. NKBOR, a mini-Tn10-based transposon for random insertion in the chromosome of Gram-negative bacteria and the rapid recovery of sequences flanking the insertion sites in Escherichia coli. Res Microbiol. 152 (5), 481-485 (2001).
- Shafferman, A., Helinski, D. R. Structural properties of the beta origin of replication of plasmid R6K. J Biol Chem. 258 (7), 4083-4090 (1983).
- Gonzales, M. F., Brooks, T., Pukatzki, S. U., Provenzano, D. Rapid protocol for preparation of electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae. J Vis Exp. (80), (2013).
- Smith, D. R. Random primed labeling of DNA. Methods Mol Biol. 18, 445-447 (1993).
- Lobner-Olesen, A., von Freiesleben, U. Chromosomal replication incompatibility in Dam methyltransferase deficient Escherichia coli cells. EMBO J. 15 (21), 5999-6008 (1996).
- Harrison, R. W., Miller, J. C., D’Souza, M. J., Kampo, G. Easy gene walking. Biotechniques. 22 (4), 650-653 (1997).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
- Stepankiw, N., Kaidow, A., Boye, E., Bates, D. The right half of the Escherichia coli replication origin is not essential for viability, but facilitates multi-forked replication. Mol Microbiol. 74 (2), 467-479 (2009).
- Lobner-Olesen, A. Distribution of minichromosomes in individual Escherichia coli cells: implications for replication control. EMBO J. 18 (6), 1712-1721 (1999).
- Lobner-Olesen, A., Skarstad, K., Hansen, F. G., von Meyenburg, K., Boye, E. The DnaA protein determines the initiation mass of Escherichia coli K-12. Cell. 57 (5), 881-889 (1989).
- Carver, T., Thomson, N., Bleasby, A., Berriman, M., Parkhill, J. DNAPlotter: circular and linear interactive genome visualization. Bioinformatics. 25 (1), 119-120 (2009).
- Eckert, S. E., et al. Retrospective application of transposon-directed insertion site sequencing to a library of signature-tagged mini-Tn5Km2 mutants of Escherichia coli O157:H7 screened in cattle. J Bacteriol. 193 (7), 1771-1776 (2011).
- van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
- van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
- Jeong, H., Lee, S. J., Kim, P. Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat. J Vis Exp. (115), (2016).
- Bryant, J. A., Sellars, L. E., Busby, S. J., Lee, D. J. Chromosome position effects on gene expression in Escherichia coli K-12. Nucleic Acids Res. 42 (18), 11383-11392 (2014).
- Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
