Summary

Determinación de la óptima Localización cromosómica de un elemento de DNA en Escherichia coli utilizando un nuevo enfoque mediada por transposones

Published: September 11, 2017
doi:

Summary

Aquí, el poder de una inserción al azar de un elemento de DNA no codificante mediada por transposones se utilizó para resolver su posición cromosómica óptima.

Abstract

La posición o posiciones cromosómica óptima de un determinado elemento de ADN fue/fueron determinada por la inserción al azar mediada por transposones, seguido por la selección de fitness. En bacterias, el impacto del contexto genético de la función de un elemento genético puede ser difícil de evaluar. Varios mecanismos, incluyendo efectos topológicos, interferencia transcripcional de genes vecinos, o dosis de gen asociado de replicación, pueden afectar la función de un elemento genético. Aquí, describimos un método que permite la integración al azar de un elemento de DNA en el cromosoma de Escherichia coli y seleccionar las ubicaciones más favorables mediante una competencia de crecimiento simple experimentan. El método aprovecha de un bien-descrito transposones-sistema de inserción al azar, juntada con una selección de los más aptos clone(s) ventaja del crecimiento, un procedimiento que es fácilmente ajustable a las necesidades experimentales. Puede determinarse la naturaleza de la clone(s) más aptos por todo el genoma que ordenaba en una población clonal múltiples compleja o por gene fácil para la identificación rápida de clones seleccionados. Aquí, la región no codificante de ADN DARS2, que controla la iniciación de la replicación del cromosoma de e. coli, fue utilizada como ejemplo. La función de DARS2 es conocida por ser afectados por dosis de gen asociado de replicación; el más DARS2 obtiene el origen de replicación del ADN, más activo se convierte. DARS2 fue insertado al azar en el cromosoma de un DARS2-elimina la tensión. Los clones resultantes que contienen inserciones individuales se agruparon y compitieron entre sí a cientos de generaciones. Finalmente, los clones más aptos se caracteriza y contiene DARS2 en proximidad cercana a la ubicación original de DARS2 .

Introduction

La función de cualquier elemento genético puede verse afectada por su localización en el genoma. En las bacterias, esto resulta fundamentalmente de interferencia por la transcripción de genes vecinos, local topología de ADN o dosis de gen asociado de replicación. En particular, los procesos de replicación del DNA y la segregación son controlados, al menos en parte, por las regiones cromosómicas no codificante1y el funcionamiento de estas regiones depende de situación/contexto genómico. En e. coli, los ejemplos son el sitio de dif , necesario para la hermana de resolución del cromosoma2; Secuencias KOPS, necesarias para de la segregación del cromosoma3; datos, DARS1y DARS2 regiones, requeridas para el control de la replicación cromosómica adecuada (abajo; 4). se presenta un método que permite la reubicación al azar, la selección y la determinación del contexto genético óptimo de cualquier elemento genético, ejemplificados aquí por el estudio de la región no codificante de DARS2 .

En e. coli, DnaA es la proteína del iniciador responsable de filamento de la DNA en la replicación solo origenoriCy para la contratación de la helicasa DnaB5,6,7. DnaA pertenece a la AAA+ (es decir, asociados a diversas actividades de ATPasas) proteínas y puede enlazar ATP y ADP con similar alta afinidad5. El nivel de DnaAATP picos en iniciación8, donde DnaAATP forma un multimer en oriC que activa el ADN dúplex apertura9. Después de la iniciación, oriC se hace disponible para la iniciación debido a secuestro por un mecanismo que implica el atascamiento de la proteína SeqA hemimethylated oriC10,11. Durante el secuestro, se reduce el nivel de DnaAATP por al menos dos mecanismos: la regulación inactivación de DnaA (RIDA)12,13 y datos-DnaA dependienteATP hidrólisis (DDAH)14 ,15. RIDA y DDAH promoción la conversión de DnaAATP aADPde DnaA. Antes de una nueva ronda de iniciación, DnaAADP se reactiva a DnaAATP en secuencias específicas de reactivación de DnaA (DARS): DARS1 y DARS216,17. La cromosómica datos, DARS1y DARS2 regiones son no codificante y actuar de una manera como acompañante para modular DnaAATPADP interconversión de /DnaA. Estas regiones, las afueras del origen de replicación, que al montaje de un complejo de DnaA para cualquiera la inactivación (datos; 14) o activación (DARS1 y DARS2; 17) de DnaA. Eliminación de DARS2 en una celda no altera masa doblar tiempo pero resulta en replicación asincrónica iniciación15,16,18. Sin embargo, DARS2-células deficientes tienen un gimnasio costo comparado con un tipo de salvaje lo contrario isogénicas durante ambos competencia de continuo crecimiento en medio rico o en el establecimiento de la colonización en el intestino de ratón18. Esto indica que incluso pequeños cambios en la concentración de asincronía/origen tienen un efecto negativo en fitness bacteriano. En e. coli, hay una presión selectiva para mantener la simetría (es decir, dos brazos de la replicación de casi igual longitud) de cromosoma19. Los datos, DARS1y DARS2 regiones tienen la misma distancia relativa a oriC en todo e. coli cepas secuenciadas18, a pesar de grandes variaciones en el tamaño del cromosoma.

Aquí, utilizamos la región DARS2 de e. coli como ejemplo para la identificación de los puestos cromosómicas óptimos para su función. DARS2 fue insertado en el transposon NKBOR y la resultante NKBOR:: transposonDARS2 posteriormente se inserta al azar en el genoma de MG1655 ΔDARS2. Así generó una colección de células, cada posesión DARS2 colocado en un lugar diferente en el cromosoma. Se realizó un en vitro competencia experimento, donde todas las células de la colección fueron agrupadas y compitieron entre sí durante el crecimiento continuo en libras para un estimado generaciones 700. El resultado del experimento de competencia monitoreados/determinó mediante Southern blot, gene fácil caminar y secuenciación del genoma completo (gt; Figura 1). Clones de punto final resueltas por gene fácil caminar se caracterizaron por citometría de flujo para evaluar los parámetros de ciclo celular. En un análisis cytometric del flujo, tamaño de celda, el contenido de ADN y sincronía de iniciación se pueden medir para un gran número de células. En citometría de flujo, un flujo de células pasa un haz de luz de la longitud de onda adecuada para excitar el ADN teñido, que entonces está simultáneamente registrado por photomultipliers que recogen la fluorescencia emitida, una medida de contenido de ADN, siempre la las células se tiñen para ADN. La luz dispersada hacia adelante es una medida de masa celular20.

El experimento de competencia en vitro que presentamos aquí se utiliza para abordar las cuestiones relativas a la importancia de la posición cromosómica y el contexto genómico del elemento genético. El método es fácil de usar e imparcial.

Protocol

1. colección de la biblioteca del Transposon Nota: el locus cromosómico de DARS2 fue clonado en la mini Tn 10-basado transposon, NKBOR (en pNKBOR) 21, resultando en NKBOR:: DARS2 (pJFM1). pNKBOR pueden obtenerse en línea 22. pNKBOR es un vector basado en R6K suicida que requiere el π de la proteína del iniciador para replicación 23. Plásmido pJFM1 por lo tanto es capaz de replicar en un…

Representative Results

Una mancha blanca /negra meridional fue hecha para verificar que DARS2 se distribuyó al azar a lo largo del cromosoma en la biblioteca de transposon (t = 0) y que los clones más aptos persistiría en el tiempo. El Southern blot fue realizada en la DNA extraída de la piscina de transposon inicial (en t = 0) y cada 100 estimado de 700 generaciones de competencia (figura 3). Aquí, la DNA celular total de cada punto del tiempo fue digerido con Pv…

Discussion

La metodología utilizada aquí toma ventaja de las técnicas de vanguardia para responder a una pregunta difícil con respecto a la posición óptima de genomic de un elemento genético. La inserción al azar del elemento genético (mediada por el transposon) permite la fácil y rápida recopilación de miles de clones, que luego se pueden hacer para competir entre sí para seleccionar la posición óptima del elemento genético investigado (es decir, el clon más apto).

Aquí, D…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores fueron financiados por subvenciones de la Fundación de Novo Nordisk, la Fundación Lundbeck y la Fundación Nacional de investigación danés (DNRF120) a través del centro de respuesta bacteriana al estrés y persistencia (BASP).

Materials

Autoclaved Mili-Q water None
Electroporation Cuvettes, 0.1 cm Thermo Fisher Scientific P41050
Bio-Rad MicroPulser Electroporation System Bio-Rad 165-2100
LB Broth Thermo Fisher Scientific 12780029 
LB Agar, powder (Lennox L agar) Thermo Fisher Scientific 22700025
Glycerol Thermo Fisher Scientific 17904
Fisherbrand Plastic Petri Dishes Fisher Scientific S33580A
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-53A
Nunc CryoTubes Sigma-Aldrich V7634 
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) Thermo Fisher Scientific F530S
dATP, [α-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 µCi PerkinElmer BLU012H250UC
DECAprime II DNA Labeling Kit Thermo Fisher Scientific AM1455
Spectrophotometer  SF/MBV/03.32 Pharmacia
Hermle Centrifuge    SF/MBV/03.46 Hermle
Ole Dich Centrifuge  SF/MBV/03.29 Ole Dich
Eppendorftubes 1.5 mL Sigma-Aldrich T9661
Eppendorftubes 2.0 mL Sigma-Aldrich T2795
Sodium Chloride Merck 6404
96% Ethanol Sigma-Aldrich 16368
Trizma HCl Sigma-Aldrich T-3253
Phenol Ultra Pure BRL 5509UA
Chloroform Merck 2445
Ribonuclease A type II A Sigma-Aldrich R5000
Sodiumdodecylsulphate (SDS) Merck 13760
Lysozyme Sigma-Aldrich L 6876
Isopropanol Sigma-Aldrich 405-7
0.5M Na-EDTA pH 8.0 BRL 5575 UA
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 10106801001
PvuI (10 U/µL) Thermo Fisher Scientific ER0621
UltraPure Agarose Thermo Fisher Scientific 16500500
DNA Gel Loading Dye (6X) Thermo Fisher Scientific R0611
Tris-Borate-EDTA buffer Sigma-Aldrich T4415
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 433160
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 71687
Whatman 3MM papers Sigma-Aldrich WHA3030931
SSC Buffer 20× Concentrate Sigma-Aldrich S6639
Amersham Hybond-N+ GE Healthcare RPN119B
Ficoll 400 Sigma-Aldrich F8016
Polyvinylpyrrolidone Sigma-Aldrich PVP40
Bovine Serum Albumin – Fraction V Sigma-Aldrich 85040C
Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes Sigma-Aldrich D1626
Carestream Kodak  BioMax  light film Sigma-Aldrich Z373494
GenElute  Gel Extraction Kit Sigma-Aldrich NA1111 
GenElute  PCR Clean-Up Kit Sigma-Aldrich NA1020
T100  Thermal Cycler Bio-Rad
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad
Rifampicin Serva 34514.01
Cephalexin Sigma-Aldrich C4895
Mithramycin Serva 29803.02
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich 246964
Apogee A10 instrument Apogee

References

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Frimodt-Møller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Løbner-Olesen, A. Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach. J. Vis. Exp. (127), e55946, doi:10.3791/55946 (2017).

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