Подкожный нейротрофин 4 Вливание с использованием осмотических насосов или прямой мышечной инъекции Усиление боли в горле гортани
Summary
Здесь мы представляем протокол для описания использования нейротрофина 4 (NTF4) системно и непосредственно для ремоделирования мышц гортани, стареющих на коже.
Abstract
Дисфункция гортани у пожилых людей является основной причиной инвалидности: от нарушений речи до дисфагии и потери защитных рефлексов дыхательных путей. Немногие, если таковые имеются, существуют методы лечения возрастной дисфункции гортани. Нейротрофины участвуют в мышечной иннервации и дифференциации нервно-мышечных узлов (NMJ). Считается, что нейротрофины усиливают нервно-мышечную передачу путем увеличения высвобождения нейротрансмиттеров. Нервно-мышечные соединения (NMJ) становятся меньше и менее многочисленны в стареющих мышцах гортани крысы, что свидетельствует о функциональной денервации. Мы изучили влияние NTF4 для будущего клинического применения в качестве терапевтического средства для улучшения функции старения человеческих гортанных мышц. Здесь мы предоставляем подробный протокол для системного применения и прямого впрыска NTF4 для изучения способности стареющей мышцы гортани крысы ремоделировать в ответ на применение NTF4. В этом методе крысы либо получали NTF4 либо системно через oSmotic насоса или путем прямого впрыска через голосовые складки. Затем мышцы гортани были рассечены и использованы для гистологического исследования морфологии и возрастной денервации.
Introduction
Мышцы гортани быстро и последовательно сокращаются и подвержены неблагоприятным последствиям старения. Считается, что эта постоянная активность способствует голодным проблемам или дисфагии, наблюдаемым у лиц старше 65 лет 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Несколько молекулярных и патофизиологических механизмов способствуют этой возрастной дисфункции. Эти механизмы могут включать ремоделирование слизистой оболочки гортани, атрофию или потерю мышечных волокон, отсутствие регенерации мышечных волокон или атрофию, которая вызывает поклоны голосовых складок и неспособность закрыть лоскут 8 , 9 , 10 , 11 . В настоящее время нет доказанной медицинской терапии, которая можетПредотвращают или реабилитируют эти возрастные изменения в этих мышцах.
Модуляция эффективности нервно-мышечной передачи может значительно влиять на работу нейромотора. Семейство нейротрофинов включает фактор роста нервов (NGF), фактор роста нервных клеток мозга (BDNF), нейротрофин 3 (NTF3) и NTF4 12 , 13 . Показано, что нейротрофины модулируют синаптическую эффективность 1 , 4 . Фактор роста гепатоцитов, трансформирующий фактор роста бета и фактор роста фибробластов, недавно были использованы у людей для лечения рубцов 15-17 лет . NTF4 также регулирует эффективность NMJ; Мышей, не имеющих NTF4, показывают разобранные NMJs 11 , 18 , 19 . Эти исследования приводят к многообещающим последствиям леченияТ стареющих расстройств гортани и денервации с факторами роста.
Терапия прямой инъекции тканям голосовых складок не является беспрецедентной для человека. Например, местные инъекции ботулинического токсина в настоящее время используются в качестве эффективного лечения нарушений неврологического движения, которые влияют на мышцы гортани, такие как спазматическая дисфония и двусторонний рецидивирующий паралич гортани нерва 20 , 21 . Гигель гиалуроновой кислоты является еще одним инъекционным средством, которое используется для лечения шрамов вокальных складок и гортанной недостаточности 22 , 23 . Инъекционная ларингопластика может использоваться для лечения различных нарушений связи 24 . Эти прямые методы инъекции обещают улучшить вокальную функцию и глотать в популяциях старения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мускулы гортани уязвимы к неблагоприятным последствиям старения. Предыдущие исследования продемонстрировали изменения в стареющих мышцах гортани, которые включают изменения размера волокна, общее количество волокон, регенеративную способность, размер и количественные изменения NMJ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами Национального института глухоты и других нарушений связи (R21DC010806 – CAM и JCS и R01DC011285 – CAM).
Materials
| Neurotrophin 4 | Pepro Tech | 450-04 | 200ng in 50μl |
| Alzet Osmotic Pump | DURECT Corporation | 2001D | |
| 30° endoscope | Stoltz | 61029D | |
| 50mm 30 gauge 100-μl syringe | Hamilton | 84850 and 201812 | |
| saline (sodium chloride solution) | Sigma-Aldrich | S8776 | |
| ketamine hydrochloride | Henry Schein | 56344 | |
| xylazine hydrochloride | Henry Schein | 33198 | |
| 25 G 5/8 needle | Becton-Dickinson | 305901 | |
| 1 ml syringe | Becton-Dickinson | 309659 | |
| ophthalmic ointment | Henry Schein | 8897 | |
| clippers | Oster | 44-018 | |
| ethanol | Decon | 2716 | |
| iodine (Betadine) | Purdue Pharma L.P. | 606404 | |
| heating pad | Sunbeam | 731-5 | |
| 5-0 nylon suture thread | AD Surgical | PMN-518R6 | |
| crile hemostat | Fine Science Tools | 13005-14 | |
| delicate suture tying forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| meloxicam | Henry Schein | 49756 | |
| carprofen | Merritt Veterinary Supplies | 148700 | |
| antibiotic ointment | Henry Schein | 57110 | |
| acepromizine Aceproject | Henry Schein | 3845 | |
| isoflurane Isothesia | Henry Schein | 50033 | |
| induction box (anesthetizing box) | Harvard Apparatus | 50-0116 | |
| oxygen compressed tank | Scott Gross | UN1072 | |
| plexiglas platform | Small Parts Inc (Amazon) | ||
| rubber tipped forceps | Fine science tools rubber | 11075-00 | |
| liquid rubber for forceps above | Lowe's | 42518 | |
| plastic spectula (BD syringe cut to length) | Becton-Dickinson | 309659 | |
| halogen light source rhino-laryngeal stroboscope | Kay-Pentax | RLS 9100 B | |
| video recorder | Kay-Pentax | ||
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-500G | |
| phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| cryostat Mictotom HM525 | Thermo Scientific | HM 525 | |
| Gill 1 hematoxylin | VWR | 10143-142 | |
| Shandon eosin-Y alcoholic | Thermo Fisher Scientific | 6766007 | |
| anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | S0819 | |
| Texas red-X phalloidin | Sigma-Aldrich | T7471 | |
| alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | B-13422 | |
| Small animal anaesthesia machine | Smiths Medical | CDS 9000 |
References
- Trupe, E. H., et al. Correlates and consequences of eating dependency in institutionalized elderly. J. Am. Geriatrics Society. 34 (3), 192-198 (1986).
- Ward, P. H., Colton, R., McConnell, F., Malmgren, L., Kashima, H., Woodson, G. Aging of the voice and swallowing. Otolaryngol. Head Neck Surg. 100 (4), 283-286 (1989).
- Gay, E. G., Kronenfeld, J. J., Dettmann, F. G. A comparison on the effect of regulation on health care for the older American: a tale of two states. Gerontologist. 34 (6), 787-796 (1994).
- Hagen, P., Lyons, G. D., Nuss, D. W. Dysphonia in the elderly:diagnosis and management of age-related voice changes. South. Med. J. 89 (2), 204-207 (1996).
- Broniatowski, M., et al. Current evaluation and treatment of patients with swallowing disorders. Otolaryngol. Head Neck Surgery. 120 (4), 464-473 (1999).
- Lundy, D. S., et al. Aspiration: cause and implications. Otolaryngol. Head Neck Surg. 120 (4), 474-478 (1999).
- Schindler, J. S., Kelly, J. H. Swallowing disorders in the elderly. Laryngoscope. 112 (4), 589-602 (2002).
- Gambino, D. R., Malmgren, L. T., Gacek, R. R. Age-related changes in the neuromuscular junctions in the human posterior cricoarytenoid muscles: a quantitative study. Laryngoscope. 100 (3), 262-268 (1990).
- Sinard, R. J. The aging voice: how to differentiate disease from normal changes. Geriatrics. 53 (7), 76-79 (1998).
- Baker, K. K., Olson-Raming, L., Sapir, S., Luschei, E. S., Smith, M. E. Control of vocal loudness in young and old adults. J. Speech Lang. Hear Res. 44 (2), 297-305 (2001).
- McMullen, C. A., Andrade, F. H. Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 64 (4), 435-442 (2009).
- Lai, K., Ip, N. Y. Postsynaptic signaling of new players at the neuromuscular junction. J. Neurocytol. 32 (5-8), 727-741 (2003).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu. Rev. Neurosci. 24 (1), 677-736 (2012).
- Gonzalez, M., et al. Disruption of Trkb mediated signaling induces disassembly of postsynaptic receptor clusters at neuromuscular junctions. Neuron. 24 (3), 567-583 (1999).
- Hirano, S., Kishimoto, Y., Suehiro, A., Kanemaru, S., Ito, J. Regeneration of aged vocal folds: first human case treated with fibroblast growth factor. Laryngoscope. 118 (12), 2254-2259 (2008).
- Branski, R. C., et al. Effects of transforming growth factor-beta 1 on human vocal fold fibroblasts. Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 118 (3), 218-226 (2009).
- Kishimoto, Y., et al. Effects of exogenous hepatocyte growth factor on vocal fold fibroblasts. Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 118 (8), 606-611 (2009).
- Belluardo, N., et al. Neuromuscular junction disassembly and muscle fatigue in mice lacking neurotrophin-4. Mol. Cell. Neurosci. 18 (1), 56-57 (2001).
- Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanisms in the old rat. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68 (12), 1458-1468 (2013).
- Roscow, D. E., Parikh, P., Vivero, R. J., Casiano, R. R., Lundy, D. S. Considerations for initial dosing of botulinum toxin in treatment of adductor spasmodic dysphonia. Oto. HeadNeck Surg. 148 (6), 1003-1006 (2013).
- Benninger, M. S., Hanick, A., Hicks, D. M. Cricothyroid muscle botulinum toxin injection to improve airway for bilateral recurrent laryngeal nerve paralysis, A case series. J. Voice. 30 (1), 96-99 (2016).
- Coppoolse, J. M. S., et al. An in vivo study of composite microgels based on hyaluronic acid and gelatin for the reconstruction of surgically injured rat vocal folds. J. Speech Lang Hear Res. 57 (2), S658-S673 (2014).
- Hertegård, S., et al. Cross-linked hyaluronan used as augmentation substance for treatment of glottal insufficiency: Safety aspects and vocal fold function. Laryngoscope. 112 (12), 2211-2219 (2002).
- Walker, W. F., Homberger, D. G. . Anatomy and dissection of the rat. , (1997).
- Ohno, T., Hirano, S., Rousseau, B. Age-associated changes in the expression and deposition of vocal fold collagen and hyaluronan. Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 25 (1), 192-197 (2009).
- Stemple, J. C., et al. Enhancement of aging rat laryngeal muscles with endogenous growth factor treatment. Physiol. Rep. 4 (10), e12798 (2016).
- McMullen, C. A., Andrade, F. H. Contractile dysfunction and altered metabolic profile of the aging rat thyroarytenoid muscle. J. Appl. Phys. 100 (2), 602-608 (2006).
- Engle, W. K., Cunningham, G. C. Rapid examination of muscle tissue. An improved trichrome method for fresh-frozen biopsy section. Neurology. (13), 919-923 (1963).
- Sheehan, D. C., Hrapchack, B. B. Theory and practice of histotechnology. Battelle. , (1980).
- Kulakowski, S. A., Parker, S. D., Personius, K. E. Reduced TrkB expression results in precocious age-like changes in neuromuscular structure, neurotransmission, and muscle function. J. Appl. Phys. 111 (3), 844-852 (2011).
- Nishida, N., et al. Age-related change in rat intrinsic laryngeal muscles: analysis of muscle fibers, muscle fiber proteins and subneural apparatuses. Eur Arch Otorhinolaryngol. 270 (3), 975-984 (2013).
