Summary

תת עורית נוירוטרופין 4 עירוי באמצעות אוסמוטי משאבות או הזרקת שרירים ישירה משפר הזדקנות עכברים שרירי הלוע.

Published: June 13, 2017
doi:

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לתאר את השימוש של neurotrophin 4 (NTF4) באופן שיטתי ישירות כדי לשפץ עכברוש ההזדקנות שרירים הגרון.

Abstract

תפקוד לקוי של הגרון אצל קשישים הוא גורם עיקרי לחולי נכות, מהפרעות קוליות ועד לקשיי ראייה ואובדן רפלקסים מגנים על דרכי הנשימה. מעטים, אם בכלל, קיימים טיפולים כי המטרה גיל הקשורים לתפקוד שרירים בגרון. נויטרופונים מעורבים בעצב שרירים ובידול של צמתים ניירומוסקולריים (NMJs). הוא חשב כי neurotrophins לשפר את העברת neuromuscular על ידי הגדלת שחרור נוירוטרנסמיטר. הצמתים הניירומוסקולריים (NMJ) הופכים קטנים יותר ופחות בשפע בשרירי הגרון העכברים המזדקנים, עם ראיות לשימור תפקודי. בחנו את ההשפעות של NTF4 לשימוש קליני עתידי כטיפול לשיפור תפקוד ההזדקנות בשרירי הגרון האנושיים. כאן, אנו מספקים את פרוטוקול מפורט עבור יישום מערכתי הזרקת ישירה של NTF4 לחקור את היכולת של הזדקנות חולדה עכברוש הגרון לשפץ בתגובה יישום NTF4. בשיטה זו, חולדות או קיבלו NTF4 או באופן שיטתי דרך oמשאבה סמוטית או על ידי הזרקה ישירה דרך קפל ווקאלי. שרירי הלוע היו אז גזור ומשמש לבדיקת היסטולוגית של מורפולוגיה ושימור הקשורים לגיל.

Introduction

שרירי הגרון מתכווצים במהירות ועקביות, והם פגיעים לתופעות הלוואי של ההזדקנות. פעילות מתמדת זו נחשבת לתורמת לבעיות קוליות או לדיספגיה שנצפתה אצל אנשים מעל גיל 65 שנים , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . מספר מנגנונים מולקולריים ו פתופיזיולוגיים תורמים לתפקוד לקוי הקשור לגיל. מנגנונים אלה יכולים לכלול שיפוץ של רירית הגרון, ניוון שריר או אובדן, חוסר סיבים שריר התחדשות או ניוון אשר גורם קשת של קפל ווקאלי חוסר יכולת של הסגר 8 , 9 , 10 , 11 . אין טיפול רפואי מוכח בשלב זה יכול comלמנוע או לשקם שינויים אלה הקשורים לגיל אלה שרירים.

אפנון האפקטיביות של שידור neuromuscular יכול להשפיע מאוד על הביצועים neuromotor. משפחת הנוירוטרופים כוללת גורם לגדילה עצבית (NGF), גורם גדילה עצבי המופק על ידי המוח (BDNF), נוירוטרופין 3 (NTF3) ו- NTF4 12 , 13 . נוירוטרופים הוכחו כדי לווסת את יעילות הסינפטי 1 , 4 . גורם הצמיחה hepatocyte, הפיכת גורם גדילה ביתא גורם הגידול fibroblast לאחרונה נעשה שימוש בבני אדם לטיפול הצטלקות קפל 15 17 . NTF4 גם מסדיר את יעילות NMJ; עכברים חסרים NTF4 להראות מפורקים NMJs 11 , 18 , 19 . מחקרים אלה מובילים להשפעות מבטיחות של מטפליםT של הזדקנות שרירים הגרון ואת שימור עם גורמי גדילה.

טיפול הזרקה ישירה לרקמות של קפל ווקאלי הם לא תקדים בבני אדם. לדוגמה, זריקות מקומיות של toxin botulinum משמשים כיום כטיפול יעיל להפרעות תנועה נוירולוגיות המשפיעות על השרירים בגרון, כגון דיספוניה של עוויתות ושיתוק עצבי חוזר דו-צדדי חוזר 20 , 21 . חומצה היאלורונית הידרוגנית נוספת היא זריקה, המשמשת לטיפול מפחיד ווקאלי קיפול וחסר glutal 22 , 23 . הזריקה laryngoplasty ניתן להשתמש כדי לטפל במגוון של הפרעות בתקשורת 24 . שיטות הזרקה ישירה אלו מקיימות הבטחה לשיפור תפקוד הקול והבלעה באוכלוסיות ההזדקנות.

Protocol

השתמש זכר Fischer 344-Brown חולדות נורבגיה בגיל 6 ו 30 חודשים של גיל עבור פרוטוקול זה. חולדות התקבלו מן המכון הלאומי של זקנה מכרסמים המושב. השתמשנו עכברושים עבור מחקר זה, כי המבנה של הגרון חולדה דומה לזו של האדם, פונקציונלית המשרתים להגנה על דרכי הנשימה ו vocalizations המין המיוחד מחק…

Representative Results

חולדות היו מורדמים לאחר שבועיים של עירוי משאבת אוסמוטי או 1 שבוע לאחר הזרקה ישירה של NTF4. Larynges נקצרו, הניח cryoprotectant (סוכרוז 30% ו 70% פוספט שנאגרו מלוחים) ולאחר מכן מקוטע סדרתי ברוחב 10 מיקרומטר עם cryostat. הזדקנות שרירי הגרון מושפעים על ידי הממשל של NTF4 <sup class="xr…

Discussion

שרירי הגרון חשופים להשפעות של הזדקנות. מחקרים קודמים הראו שינויים בשרירי הגרון המזדקנים הכוללים שינויים בגודל הסיבים, מספר הסיבים הכולל, יכולת התחדשות, גודל NMJ ושינויים בכמות, בנוסף לשינויים בתפקוד הקונסטרוקלי ובמיוסין איזופורם משמרות 4 , <sup class="xre…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לחירשות והפרעות תקשורת אחרות (R21DC010806 ל- CAM ו- JCS ו- R01DC011285 ל- CAM).

Materials

Neurotrophin 4 Pepro Tech 450-04 200ng in 50μl
Alzet Osmotic Pump DURECT Corporation 2001D
30° endoscope Stoltz 61029D
50mm 30 gauge 100-μl syringe Hamilton 84850 and 201812
saline (sodium chloride solution) Sigma-Aldrich S8776
ketamine hydrochloride Henry Schein 56344
xylazine hydrochloride Henry Schein 33198
25 G 5/8 needle Becton-Dickinson 305901
1 ml syringe Becton-Dickinson 309659
ophthalmic ointment Henry Schein 8897
clippers Oster 44-018
ethanol Decon 2716
iodine (Betadine) Purdue Pharma L.P. 606404
heating pad Sunbeam 731-5
5-0 nylon suture thread AD Surgical PMN-518R6
crile hemostat Fine Science Tools 13005-14
delicate suture tying forceps Fine Science Tools 11063-07
meloxicam Henry Schein 49756
carprofen Merritt Veterinary Supplies 148700
antibiotic ointment Henry Schein 57110
acepromizine Aceproject Henry Schein 3845
isoflurane Isothesia Henry Schein 50033
induction box (anesthetizing box) Harvard Apparatus 50-0116
oxygen compressed tank Scott Gross UN1072
plexiglas platform Small Parts Inc (Amazon)
rubber tipped forceps Fine science tools rubber 11075-00
liquid rubber for forceps above Lowe's 42518
plastic spectula (BD syringe cut to length) Becton-Dickinson 309659
halogen light source rhino-laryngeal stroboscope Kay-Pentax RLS 9100 B
video recorder Kay-Pentax
sucrose Sigma-Aldrich S0389-500G
phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P4417-100TAB
cryostat Mictotom HM525 Thermo Scientific HM 525
Gill 1 hematoxylin VWR 10143-142
Shandon eosin-Y alcoholic Thermo Fisher Scientific 6766007
anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbit Sigma-Aldrich S0819
Texas red-X phalloidin Sigma-Aldrich T7471
alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugate Thermo Fisher Scientific B-13422
Small animal anaesthesia machine Smiths Medical CDS 9000

References

  1. Trupe, E. H., et al. Correlates and consequences of eating dependency in institutionalized elderly. J. Am. Geriatrics Society. 34 (3), 192-198 (1986).
  2. Ward, P. H., Colton, R., McConnell, F., Malmgren, L., Kashima, H., Woodson, G. Aging of the voice and swallowing. Otolaryngol. Head Neck Surg. 100 (4), 283-286 (1989).
  3. Gay, E. G., Kronenfeld, J. J., Dettmann, F. G. A comparison on the effect of regulation on health care for the older American: a tale of two states. Gerontologist. 34 (6), 787-796 (1994).
  4. Hagen, P., Lyons, G. D., Nuss, D. W. Dysphonia in the elderly:diagnosis and management of age-related voice changes. South. Med. J. 89 (2), 204-207 (1996).
  5. Broniatowski, M., et al. Current evaluation and treatment of patients with swallowing disorders. Otolaryngol. Head Neck Surgery. 120 (4), 464-473 (1999).
  6. Lundy, D. S., et al. Aspiration: cause and implications. Otolaryngol. Head Neck Surg. 120 (4), 474-478 (1999).
  7. Schindler, J. S., Kelly, J. H. Swallowing disorders in the elderly. Laryngoscope. 112 (4), 589-602 (2002).
  8. Gambino, D. R., Malmgren, L. T., Gacek, R. R. Age-related changes in the neuromuscular junctions in the human posterior cricoarytenoid muscles: a quantitative study. Laryngoscope. 100 (3), 262-268 (1990).
  9. Sinard, R. J. The aging voice: how to differentiate disease from normal changes. Geriatrics. 53 (7), 76-79 (1998).
  10. Baker, K. K., Olson-Raming, L., Sapir, S., Luschei, E. S., Smith, M. E. Control of vocal loudness in young and old adults. J. Speech Lang. Hear Res. 44 (2), 297-305 (2001).
  11. McMullen, C. A., Andrade, F. H. Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 64 (4), 435-442 (2009).
  12. Lai, K., Ip, N. Y. Postsynaptic signaling of new players at the neuromuscular junction. J. Neurocytol. 32 (5-8), 727-741 (2003).
  13. Huang, E. J., Reichardt, L. F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu. Rev. Neurosci. 24 (1), 677-736 (2012).
  14. Gonzalez, M., et al. Disruption of Trkb mediated signaling induces disassembly of postsynaptic receptor clusters at neuromuscular junctions. Neuron. 24 (3), 567-583 (1999).
  15. Hirano, S., Kishimoto, Y., Suehiro, A., Kanemaru, S., Ito, J. Regeneration of aged vocal folds: first human case treated with fibroblast growth factor. Laryngoscope. 118 (12), 2254-2259 (2008).
  16. Branski, R. C., et al. Effects of transforming growth factor-beta 1 on human vocal fold fibroblasts. Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 118 (3), 218-226 (2009).
  17. Kishimoto, Y., et al. Effects of exogenous hepatocyte growth factor on vocal fold fibroblasts. Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 118 (8), 606-611 (2009).
  18. Belluardo, N., et al. Neuromuscular junction disassembly and muscle fatigue in mice lacking neurotrophin-4. Mol. Cell. Neurosci. 18 (1), 56-57 (2001).
  19. Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanisms in the old rat. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68 (12), 1458-1468 (2013).
  20. Roscow, D. E., Parikh, P., Vivero, R. J., Casiano, R. R., Lundy, D. S. Considerations for initial dosing of botulinum toxin in treatment of adductor spasmodic dysphonia. Oto. HeadNeck Surg. 148 (6), 1003-1006 (2013).
  21. Benninger, M. S., Hanick, A., Hicks, D. M. Cricothyroid muscle botulinum toxin injection to improve airway for bilateral recurrent laryngeal nerve paralysis, A case series. J. Voice. 30 (1), 96-99 (2016).
  22. Coppoolse, J. M. S., et al. An in vivo study of composite microgels based on hyaluronic acid and gelatin for the reconstruction of surgically injured rat vocal folds. J. Speech Lang Hear Res. 57 (2), S658-S673 (2014).
  23. Hertegård, S., et al. Cross-linked hyaluronan used as augmentation substance for treatment of glottal insufficiency: Safety aspects and vocal fold function. Laryngoscope. 112 (12), 2211-2219 (2002).
  24. Walker, W. F., Homberger, D. G. . Anatomy and dissection of the rat. , (1997).
  25. Ohno, T., Hirano, S., Rousseau, B. Age-associated changes in the expression and deposition of vocal fold collagen and hyaluronan. Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 25 (1), 192-197 (2009).
  26. Stemple, J. C., et al. Enhancement of aging rat laryngeal muscles with endogenous growth factor treatment. Physiol. Rep. 4 (10), e12798 (2016).
  27. McMullen, C. A., Andrade, F. H. Contractile dysfunction and altered metabolic profile of the aging rat thyroarytenoid muscle. J. Appl. Phys. 100 (2), 602-608 (2006).
  28. Engle, W. K., Cunningham, G. C. Rapid examination of muscle tissue. An improved trichrome method for fresh-frozen biopsy section. Neurology. (13), 919-923 (1963).
  29. Sheehan, D. C., Hrapchack, B. B. Theory and practice of histotechnology. Battelle. , (1980).
  30. Kulakowski, S. A., Parker, S. D., Personius, K. E. Reduced TrkB expression results in precocious age-like changes in neuromuscular structure, neurotransmission, and muscle function. J. Appl. Phys. 111 (3), 844-852 (2011).
  31. Nishida, N., et al. Age-related change in rat intrinsic laryngeal muscles: analysis of muscle fibers, muscle fiber proteins and subneural apparatuses. Eur Arch Otorhinolaryngol. 270 (3), 975-984 (2013).

Play Video

Cite This Article
Andreatta, R. D., Stemple, J. C., Seward, T. S., McMullen, C. A. Subcutaneous Neurotrophin 4 Infusion Using Osmotic Pumps or Direct Muscular Injection Enhances Aging Rat Laryngeal Muscles. J. Vis. Exp. (124), e55837, doi:10.3791/55837 (2017).

View Video