Summary

Subcutane Neurotrofine 4 Infusie Met Osmotische Pompen Of Directe Spierinjectie Verbetert Veroudering Rat Larynx Spieren

Published: June 13, 2017
doi:

Summary

Hier presenteren wij een protocol om het gebruik van neurotrophin 4 (NTF4) systematisch te beschrijven en rechtstreeks te remodellen larynxale spierveroudering.

Abstract

Larynxale dysfunctie bij ouderen is een belangrijke oorzaak van handicap, van stoornissen aan dysfagie en verlies van luchtweg beschermende reflexen. Er zijn weinig, indien aanwezig, therapieën die gericht zijn op leeftijdgerelateerde larynxale spierdisfunctie. Neurotrofinen zijn betrokken bij spierinervation en differentiatie van neuromusculaire kruispunten (NMJ's). Het is van mening dat neurotrofinen neuromusculaire transmissie versterken door de vrijlating van neurotransmitteren te verhogen. De neuromusculaire kruispunten (NMJ's) worden kleiner en minder overvloedig in verouderende larynxale spieren van de rat, met bewijs van functionele denervation. We hebben de effecten van NTF4 onderzocht voor toekomstig klinisch gebruik als therapeutisch voor het verbeteren van de functie bij het verouderen van menselijke larynxspieren. Hier geven we het gedetailleerde protocol voor systemische toepassing en directe injectie van NTF4 om het vermogen van veroudering van de rat larynxale spier te onderzoeken in verband met NTF4 applicatie. Bij deze methode kregen ratten ofwel systematisch via o NTF4Smotische pomp of door directe injectie door de vocale plooien. Larynxale spieren werden vervolgens gedissecteerd en gebruikt voor histologisch onderzoek naar morfologie en leeftijdverwante denervation.

Introduction

Larynxale spieren trekken snel en consistent samen en zijn kwetsbaar voor de nadelige effecten van veroudering. Deze constante activiteit wordt geacht bij te dragen aan spraakproblemen of dysfagie waargenomen bij personen ouder dan 65 jaar 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Verscheidene moleculaire en pathofysiologische mechanismen dragen bij aan deze leeftijdgerelateerde disfunctie. Deze mechanismen kunnen remodellering van larynxmucosa, spiervezelatrofie of -verlies omvatten, gebrek aan regeneratie of atrofie van spiervezels, waardoor de vocale vouwen worden gebogen en de glottisluiting 8 , 9 , 10 , 11 niet mogelijk is . Er is geen bewezen medische therapie op dit moment dat kan comDeze leeftijdsgebonden veranderingen in deze spieren verbeteren of voorkomen.

Modulatie van de effectiviteit van neuromusculaire transmissie kan de neuromotorische prestaties sterk beïnvloeden. De familie van neurotrophins omvat zenuwgroeifactor (NGF), hersenverwante zenuwgroeifactor (BDNF), neurotrophine 3 (NTF3) en NTF4 12 , 13 . Neurotrofinen hebben aangetoond dat ze synaptische werkzaamheid 1 , 4 moduleren. Hepatocytgroeifactor, transformerende groeifactor bèta en fibroblastgroeifactor, is onlangs bij mensen gebruikt voor de behandeling van vocal fold scarring 15-17. NTF4 regelt ook de effectiviteit van de NMJ; Muizen die NTF4 ontbreken tonen gedemonteerde NMJ's 11 , 18 , 19 . Deze studies leiden tot veelbelovende effecten van behandelaarsT van veroudering van larynxale spierstoornissen en denervering met groeifactoren.

Directe injectie therapeutica aan de weefsels van de vocale vouwen zijn niet bij elkaar in de mens. Bijvoorbeeld worden lokale injecties van botulinum toxine momenteel gebruikt als een effectieve behandeling voor neurologische bewegingsstoornissen die de spieren in de larinks beïnvloeden, zoals spasmodische dysfonie en bilaterale herhalende larynxale zenuwverlamming 20 , 21 . Hyaluronzuurhydrogel is een ander injecteerbaar, dat gebruikt wordt om vocale vouwverschrikking en glottale insufficiëntie 22 , 23 te behandelen. Injectie laryngoplastie kan worden gebruikt om een ​​verscheidenheid aan communicatie stoornissen te behandelen 24 . Deze directe injectiemethoden houden belofte om de vocale functie te verbeteren en te slikken in verouderende populaties.

Protocol

Gebruik mannelijke Fischer 344-Brown Noorse ratten op 6 en 30 maanden oud voor dit protocol. Ratten werden verkregen uit het National Institute of Aging knaagdierkolonie. Wij hebben ratten gebruikt voor deze studie omdat de structuur van de larynx van de rat gelijkwaardig is aan die van de mens, functioneel voor de bescherming van de luchtwegen en soortenspecifieke vocalisaties. Deze studie is uitgevoerd in overeenstemming met het PHS-beleid inzake humane zorg en gebruik van laboratoriumdieren, De NIH Gids voor de zorg …

Representative Results

De ratten werden geëuthaniseerd na 2 weken osmotische pompinfectie of 1 week na directe injectie van NTF4. Larynges werden geoogst, geplaatst in cryoprotectant (30% sucrose en 70% fosfaat gebufferde zoutoplossing) en vervolgens serieel gesneden in 10 μm breedten met een cryostat. Veroudering van larynxale spieren wordt beïnvloed door toediening van NTF4 25 . Naast de jonge en oude rat, vergeleken we de geïnjecteerde en niet-geïnjecteerde kant van de thyroaryt…

Discussion

Larynxale spieren zijn kwetsbaar voor de ongunstige effecten van veroudering. Vorige studies hebben aangetoond veranderingen in veroudering larynxale spieren die veranderingen in vezelgrootte, totaal aantal vezels, regeneratief vermogen, NMJ grootte en hoeveelheid veranderingen omvatten, naast variaties in contractiele functie en myosine isoform verschuivingen 4 , 11 , 27 , 30 , <su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Nationaal Instituut voor Doofheid en Andere Communicatie Stoornissen (R21DC010806 naar CAM en JCS en R01DC011285 naar CAM).

Materials

Neurotrophin 4 Pepro Tech 450-04 200ng in 50μl
Alzet Osmotic Pump DURECT Corporation 2001D
30° endoscope Stoltz 61029D
50mm 30 gauge 100-μl syringe Hamilton 84850 and 201812
saline (sodium chloride solution) Sigma-Aldrich S8776
ketamine hydrochloride Henry Schein 56344
xylazine hydrochloride Henry Schein 33198
25 G 5/8 needle Becton-Dickinson 305901
1 ml syringe Becton-Dickinson 309659
ophthalmic ointment Henry Schein 8897
clippers Oster 44-018
ethanol Decon 2716
iodine (Betadine) Purdue Pharma L.P. 606404
heating pad Sunbeam 731-5
5-0 nylon suture thread AD Surgical PMN-518R6
crile hemostat Fine Science Tools 13005-14
delicate suture tying forceps Fine Science Tools 11063-07
meloxicam Henry Schein 49756
carprofen Merritt Veterinary Supplies 148700
antibiotic ointment Henry Schein 57110
acepromizine Aceproject Henry Schein 3845
isoflurane Isothesia Henry Schein 50033
induction box (anesthetizing box) Harvard Apparatus 50-0116
oxygen compressed tank Scott Gross UN1072
plexiglas platform Small Parts Inc (Amazon)
rubber tipped forceps Fine science tools rubber 11075-00
liquid rubber for forceps above Lowe's 42518
plastic spectula (BD syringe cut to length) Becton-Dickinson 309659
halogen light source rhino-laryngeal stroboscope Kay-Pentax RLS 9100 B
video recorder Kay-Pentax
sucrose Sigma-Aldrich S0389-500G
phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P4417-100TAB
cryostat Mictotom HM525 Thermo Scientific HM 525
Gill 1 hematoxylin VWR 10143-142
Shandon eosin-Y alcoholic Thermo Fisher Scientific 6766007
anti-sodium channel Nav1.5 antibody produced in rabbit Sigma-Aldrich S0819
Texas red-X phalloidin Sigma-Aldrich T7471
alpha- bungarotoxin alexa fluor 488 conjugate Thermo Fisher Scientific B-13422
Small animal anaesthesia machine Smiths Medical CDS 9000

References

  1. Trupe, E. H., et al. Correlates and consequences of eating dependency in institutionalized elderly. J. Am. Geriatrics Society. 34 (3), 192-198 (1986).
  2. Ward, P. H., Colton, R., McConnell, F., Malmgren, L., Kashima, H., Woodson, G. Aging of the voice and swallowing. Otolaryngol. Head Neck Surg. 100 (4), 283-286 (1989).
  3. Gay, E. G., Kronenfeld, J. J., Dettmann, F. G. A comparison on the effect of regulation on health care for the older American: a tale of two states. Gerontologist. 34 (6), 787-796 (1994).
  4. Hagen, P., Lyons, G. D., Nuss, D. W. Dysphonia in the elderly:diagnosis and management of age-related voice changes. South. Med. J. 89 (2), 204-207 (1996).
  5. Broniatowski, M., et al. Current evaluation and treatment of patients with swallowing disorders. Otolaryngol. Head Neck Surgery. 120 (4), 464-473 (1999).
  6. Lundy, D. S., et al. Aspiration: cause and implications. Otolaryngol. Head Neck Surg. 120 (4), 474-478 (1999).
  7. Schindler, J. S., Kelly, J. H. Swallowing disorders in the elderly. Laryngoscope. 112 (4), 589-602 (2002).
  8. Gambino, D. R., Malmgren, L. T., Gacek, R. R. Age-related changes in the neuromuscular junctions in the human posterior cricoarytenoid muscles: a quantitative study. Laryngoscope. 100 (3), 262-268 (1990).
  9. Sinard, R. J. The aging voice: how to differentiate disease from normal changes. Geriatrics. 53 (7), 76-79 (1998).
  10. Baker, K. K., Olson-Raming, L., Sapir, S., Luschei, E. S., Smith, M. E. Control of vocal loudness in young and old adults. J. Speech Lang. Hear Res. 44 (2), 297-305 (2001).
  11. McMullen, C. A., Andrade, F. H. Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 64 (4), 435-442 (2009).
  12. Lai, K., Ip, N. Y. Postsynaptic signaling of new players at the neuromuscular junction. J. Neurocytol. 32 (5-8), 727-741 (2003).
  13. Huang, E. J., Reichardt, L. F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu. Rev. Neurosci. 24 (1), 677-736 (2012).
  14. Gonzalez, M., et al. Disruption of Trkb mediated signaling induces disassembly of postsynaptic receptor clusters at neuromuscular junctions. Neuron. 24 (3), 567-583 (1999).
  15. Hirano, S., Kishimoto, Y., Suehiro, A., Kanemaru, S., Ito, J. Regeneration of aged vocal folds: first human case treated with fibroblast growth factor. Laryngoscope. 118 (12), 2254-2259 (2008).
  16. Branski, R. C., et al. Effects of transforming growth factor-beta 1 on human vocal fold fibroblasts. Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 118 (3), 218-226 (2009).
  17. Kishimoto, Y., et al. Effects of exogenous hepatocyte growth factor on vocal fold fibroblasts. Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 118 (8), 606-611 (2009).
  18. Belluardo, N., et al. Neuromuscular junction disassembly and muscle fatigue in mice lacking neurotrophin-4. Mol. Cell. Neurosci. 18 (1), 56-57 (2001).
  19. Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanisms in the old rat. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68 (12), 1458-1468 (2013).
  20. Roscow, D. E., Parikh, P., Vivero, R. J., Casiano, R. R., Lundy, D. S. Considerations for initial dosing of botulinum toxin in treatment of adductor spasmodic dysphonia. Oto. HeadNeck Surg. 148 (6), 1003-1006 (2013).
  21. Benninger, M. S., Hanick, A., Hicks, D. M. Cricothyroid muscle botulinum toxin injection to improve airway for bilateral recurrent laryngeal nerve paralysis, A case series. J. Voice. 30 (1), 96-99 (2016).
  22. Coppoolse, J. M. S., et al. An in vivo study of composite microgels based on hyaluronic acid and gelatin for the reconstruction of surgically injured rat vocal folds. J. Speech Lang Hear Res. 57 (2), S658-S673 (2014).
  23. Hertegård, S., et al. Cross-linked hyaluronan used as augmentation substance for treatment of glottal insufficiency: Safety aspects and vocal fold function. Laryngoscope. 112 (12), 2211-2219 (2002).
  24. Walker, W. F., Homberger, D. G. . Anatomy and dissection of the rat. , (1997).
  25. Ohno, T., Hirano, S., Rousseau, B. Age-associated changes in the expression and deposition of vocal fold collagen and hyaluronan. Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 25 (1), 192-197 (2009).
  26. Stemple, J. C., et al. Enhancement of aging rat laryngeal muscles with endogenous growth factor treatment. Physiol. Rep. 4 (10), e12798 (2016).
  27. McMullen, C. A., Andrade, F. H. Contractile dysfunction and altered metabolic profile of the aging rat thyroarytenoid muscle. J. Appl. Phys. 100 (2), 602-608 (2006).
  28. Engle, W. K., Cunningham, G. C. Rapid examination of muscle tissue. An improved trichrome method for fresh-frozen biopsy section. Neurology. (13), 919-923 (1963).
  29. Sheehan, D. C., Hrapchack, B. B. Theory and practice of histotechnology. Battelle. , (1980).
  30. Kulakowski, S. A., Parker, S. D., Personius, K. E. Reduced TrkB expression results in precocious age-like changes in neuromuscular structure, neurotransmission, and muscle function. J. Appl. Phys. 111 (3), 844-852 (2011).
  31. Nishida, N., et al. Age-related change in rat intrinsic laryngeal muscles: analysis of muscle fibers, muscle fiber proteins and subneural apparatuses. Eur Arch Otorhinolaryngol. 270 (3), 975-984 (2013).

Play Video

Cite This Article
Andreatta, R. D., Stemple, J. C., Seward, T. S., McMullen, C. A. Subcutaneous Neurotrophin 4 Infusion Using Osmotic Pumps or Direct Muscular Injection Enhances Aging Rat Laryngeal Muscles. J. Vis. Exp. (124), e55837, doi:10.3791/55837 (2017).

View Video