Summary

リン酸化部位決定のためのオリゴペプチド競合アッセイ

Published: May 18, 2017
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Summary

ペプチド競合アッセイは、種々の分子および免疫学的実験において広く使用されている。本稿では、in vitroオリゴペプチド競合キナーゼアッセイの詳細な方法と、特定のリン酸化部位を見出すのに有用な関連する検証手順について説明します。

Abstract

特定の部位でのタンパク質のリン酸化は、その立体配座および他の分子との相互作用を決定する。したがって、タンパク質のリン酸化は、細胞の生物学的機能および特性に影響を及ぼす。現在、リン酸化部位を発見するための最も一般的な方法は、迅速かつ高感度な方法である液体クロマトグラフィー/質量分析(LC / MS)分析によるものである。しかしながら、比較的不安定なリン酸部分は、しばしば偽陰性シグナルを生じる断片化段階の間にホスホペプチドから放出されることが多い。そのような場合、部位特異的突然変異体を用いる伝統的なインビトロキナーゼアッセイはより正確であるが、この方法は面倒で時間がかかる。したがって、ペプチド競合を用いる代替方法が有利であり得る。 5 'アデノシン一リン酸活性化プロテインキナーゼ(AMPK)のコンセンサス認識モチーフが確立されており、位置スキャニングペプチドライブラリーを用いて検証したay 2 。したがって、新規基質のAMPKリン酸化部位は、ペプチド競合アッセイによって予測および確認することができた。この報告では、AMPK媒介性核因子赤血球2関連因子2(Nrf2)リン酸化を示すことにより、インビトロオリゴペプチド競合キナーゼアッセイの詳細なステップおよび手順を記載する。リン酸化部位を認証するために、我々は部位特異的突然変異体を用いて順次in vitroキナーゼアッセイを行った。全体として、ペプチド競合アッセイは、複数の潜在的なリン酸化部位をスクリーニングし、リン酸化部位突然変異体による検証のための部位を同定する方法を提供する。

Introduction

特定の残基でのタンパク質リン酸化は、広範囲の細胞プロセスにおいて重要な役割を果たす。従って、シグナル伝達ネットワークの理解は、特異的なリン酸化部位の同定を必要とする。さらに、リン酸化部位は、タンパク質内の個々のドメインが異なる構造および機能を有するため、タンパク質機能に対する効果を決定する。主要な抗酸化転写因子である核因子エリトロイド2関連因子2(Nrf2)の活性は、異なる部位でのリン酸化によって双方向的に調節される。我々の研究は、Nrf2のリン酸化を触媒するキナーゼに焦点を当てている。酸化チャレンジに対するNrf2のストレス応答は、主にセリン40でのリン酸化を介して急速に起こり、Nrf2を活性化するプロテインキナーゼC(PKC)-δによって媒介される3,4 。逆に、Fynは、チロシン5でNrf2の阻害的リン酸化を触媒するアクティビティの厳密な制御のために68。

リン酸化部位を発見するために使用される最も一般的な方法は、液体クロマトグラフィー/質量分析(LC / MS)分析である。迅速かつ高感度なリン酸化部位マッピングデータをこのように生成することができる。しかし、それにはいくつかの技術的な制限があり、しばしば偽陰性シグナルが生成されます。シーケンスのカバレッジが悪いと、LC / MS分析で頻繁に発生します。リン酸化部位を同定するためには、タンパク質の最大アミノ酸含量に関する情報が必要である6 。消化工程中のいくつかのプロテアーゼによる目的タンパク質のタンパク質分解は、配列カバレッジを改善するのに役立つ可能性がある。リン酸化残基の同定のためのもう一つの障害は、セリンおよびトレオニンリン酸化ペプチドでしばしば観察されるリン酸の容易な損失である6,7。不安定なリン酸部分はしばしば断片化プロセス中にホスホペプチドから放出される。リン酸化部位を探索する場合の第2の選択肢は、ペプチドマイクロアレイ法を用いることである。目的のタンパク質に由来するペプチド断片を含むマイクロアレイチップを用いて、キナーゼ標的部位をスクリーニングすることが可能である。しかしながら、マイクロアレイチップの製造および検出のための装置要件のために、ペプチドマイクロアレイ法は時間がかかりかつ高価であると考えられている。

これらの課題を克服するために、インビトロオリゴペプチド競合キナーゼアッセイを、既知の認識モチーフを有するプロテインキナーゼのために使用することができる。キナーゼのコンセンサス認識モチーフが確立されれば、候補基質の推定上のリン酸化部位を予測することができ、部位の真正性を確認することができる。この手順の最も説得力のある方法は、突然変異体タンパク質におけるリン酸化の抑止を示すことであり、このタンパク質では、d残基は、非リン酸化性アミノ酸( すなわち、セリンまたはトレオニンからアラニン;チロシンからフェニルアラニン)で置換される。しかしながら、突然変異体タンパク質の産生および単離は時間がかかる。研究の初期段階における選択肢として、競合的ペプチドキナーゼアッセイは簡単で便利である。ここでは、 インビトロペプチド競合アッセイおよびリン酸化部位の確認のためのプロトコールについて記載する。

Protocol

1.安全性注意:このプロトコールでは、[γ- 32 P] -ATPを用いてAMPKの活性を評価しています。リン-32は放射性同位元素であり、主にβ線を放出する。ベータ粒子のサイズは非常に小さいので、衣類や肌に容易に浸透することができます。ベータ線への外部および内部の両方の暴露は、皮膚の火傷および組織の損傷を引き起こすことを含め、人の健康に有害な可能性があ…

Representative Results

図1と図2は、以前に報告された論文8の繰り返し実験の結果を示しています。推定上のAMPK標的部位を模倣する3つの異なる10残基オリゴペプチド(Ser153を含む#1,148-157; Ser335を含む#2,330-339;およびSer558を含む#3,553〜562)を合成し、 inインビトロキナーゼアッセイ。 AMPKによるNrf2のリン酸化は、オリゴ…

Discussion

AMPKが仲介する予測されるリン酸化部位の真正性を評価する簡単で便利な方法として、競合的なペプチドを用いて特異的なリン酸化部位を発見し、部位特異的突然変異体を用いて検証するために使用できるin vitroキナーゼアッセイをここで説明する。 。 インビトロ競合的AMPK活性アッセイから得られた代表的なデータは、部位特異的突然変異タンパク質を用いたアッセイの結果と…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、韓国政府の資金援助を受けた韓国国立研究財団(MSIP)(No. 2015R1A2A1A10052663およびNo. 2014M1A3A3A02034698)の支援を受けて行われました。

Materials

HEPES Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 15630
MgCl2 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 208337
EGTA Sigma-Aldrich, St. Louis, MO E3889
DTT Sigma-Aldrich, St. Louis, MO D9779
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO G9422
Na3VO4 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 450243
Protease inhibitor cocktail Calbiochem, Nottingham, UK 539134
ATP Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A2383
AMP Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A1752
AMPK Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY 14-840
Nrf2 (WT) Abnova, Taipei City, Taiwan H00004780-P01
[γ-32P]-ATP PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA NEG502A
EZblue staining reagent Sigma-Aldrich, St. Louis, MO G1041
Pfu turbo DNA polymerase Agilent Technologies, Santa Clara, CA 600250
dNTP mix Agilent Technologies, Santa Clara, CA 200415-51 Avoid multiple thaw and freezing cycle
DpnI New England Biolabs, Ipswich, MA R0176S
LB broth Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands L1704
Ampicillin Affymetrix, Santa Clara, CA 11259
Agarose LE iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea 32034
HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan QDF100
Coomassie Brilliant Blue R-250 Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA 161-0400
Bovine Serum Albumin Bovogen Biologicals, Victoria, Australia BSA100
Glutathione Sepharose 4B GE Healthcare, Marlborough, MA 17-0756-01
Acetic Acid glacial Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea
Methyl alcohol Daejung Chemicals & Metals, Siheung, South Korea 5558-4410
Name Company Catalog Number Comments
Typhoon FLA 7000 GE Healthcare, Marlborough, MA 28-9558-09
SDS-PAGE kit Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA 1658001FC
Vacuum pump Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA 165-178
Gel dryer Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA 165-1746
Dancing shaker FINEPCR, Seoul, Korea CR300 The machine is needed for washing step
PCR machine Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA T100
Incubator/shakers N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea NB-205L
Microcentrifuges LABOGENE, Seoul, Korea 1730R
Chromatography columns Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA 732-1010

References

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Cite This Article
Joo, M. S., Koo, J. H., Shin, S., Yim, H., Kim, S. G. Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination. J. Vis. Exp. (123), e55708, doi:10.3791/55708 (2017).

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