Summary

Analisi della concorrenza oligopeptide per la determinazione del sito di fosforilazione

Published: May 18, 2017
doi:

Summary

I test di concorrenza del peptide sono ampiamente usati in una varietà di esperimenti molecolari ed immunologici. Questo documento descrive un metodo dettagliato per un test in vitro di oligopeptide-concorrenza e le relative procedure di convalida, che possono essere utili per trovare siti specifici di fosforilazione.

Abstract

La fosforilazione della proteina in determinati siti determina la sua conformazione e l'interazione con altre molecole. Così, la fosforilazione delle proteine ​​influenza le funzioni e le caratteristiche biologiche della cellula. Attualmente, il metodo più comune per la scoperta dei siti di fosforilazione è mediante analisi liquida / cromatografia / spettrometria di massa (LC / MS), un metodo rapido e sensibile. Tuttavia, le parti fosfatiche relativamente labili sono spesso rilasciate dai fosfopeptidi durante la fase di frammentazione, che spesso produce segnali falsi negativi. In questi casi, un test tradizionale in vitro di chinasi con mutanti localizzati sul sito sarebbe più preciso, ma questo metodo è laborioso e richiede tempo. Pertanto, un metodo alternativo che utilizza concorrenza peptidica può essere vantaggioso. Il motivo di riconoscimento del consenso di 5 'adenosina monofosfato-attivato proteina chinasi (AMPK) è stato stabilito 1 e è stato convalidato utilizzando una scansione di posizionamento peptide libreria asinoAy 2 . Così, i siti di fosforilazione AMPK per un nuovo substrato potrebbero essere predittuti e confermati dai test di concorrenza peptidica. In questa relazione descriviamo le fasi e le procedure dettagliate per il test di chinasi in concorrenza con oligopeptide in vitro illustrando la fosforilazione del fattore 2 (Nrf2) correlata con eritroide 2 a fattore nucleare mediata da AMPK. Per autenticare il sito di fosforilazione, abbiamo effettuato un test sequenziale in vitro di chinasi usando un mutante specifico del sito. Nel complesso, il test di concorrenza peptide fornisce un metodo per la screening di più potenziali siti di fosforilazione e per identificare siti per la convalida da parte dei mutanti del sito di fosforilazione.

Introduction

La fosforilazione della proteina in un residuo specifico svolge un ruolo significativo in una vasta gamma di processi cellulari. Pertanto, una comprensione delle reti di segnalazione richiede l'individuazione di specifici siti di fosforilazione. Inoltre, il sito di fosforilazione determina l'effetto sulla funzione proteica perché i singoli domini all'interno di una proteina possiedono strutture e funzioni diverse. L'attività del fattore nucleare eritroide 2 correlato 2 (Nrf2), un fattore chiave di trascrizione antiossidante, è bi-direzionale regolata attraverso la fosforilazione in diversi siti. I nostri studi si sono concentrati sulle chinasi che catalizzano la fosforilazione di Nrf2. La risposta dello stress di Nrf2 contro la sfida ossidativa si verifica rapidamente, principalmente attraverso la fosforilazione in serina 40 e mediata da proteina chinasi C (PKC) -δ, che attiva Nrf2 3 , 4 . Al contrario, Fyn catalizza la fosforilazione inibitoria di Nrf2 alla tirosina 568 per un controllo stretto dell'attività 5 .

Il metodo più comune per scoprire i siti di fosforilazione è la cromatografia liquida / analisi di spettrometria di massa (LC / MS). I dati di mappatura del sito di fosforilazione rapida e altamente sensibile possono essere generati in questo modo; Tuttavia, ha diverse limitazioni tecniche, generando spesso segnali falsi negativi. Nella LC / MS analisi si riscontra frequentemente la scarsa sequenza di sequenza. Per identificare i siti di fosforilazione è richiesta informazioni sulla copertura ottimale di aminoacidi di una proteina 6 . La proteolisi della proteina di interesse con diverse proteasi durante la fase di digestione può aiutare a migliorare la copertura delle sequenze. Un altro ostacolo per l'identificazione dei residui di fosforilazione è l'immediata perdita di acido fosforico spesso osservata per i peptidi 6 , 7 , serine e treonina fosforilati. Le parti di fosfati Labile sono spessoRilasciato da fosfopeptidi durante il processo di frammentazione 7 . La seconda opzione nella ricerca di siti di fosforilazione sta utilizzando un metodo di microarray peptidico. È possibile schermare i siti di destinazione di chinasi usando un chip di microarray contenente frammenti peptidi derivanti da una proteina di interesse. Tuttavia, a causa del requisito di attrezzatura per la produzione e la rilevazione di un chip microarray, il metodo del microarray peptide è considerato tempo e costoso.

Per superare queste sfide, un test di chinasi in concorrenza in vitro con oligopeptide può essere utilizzato per una chinasi di proteina con motivi riconosciuti di riconoscimento. Se si stabilisce il motivo di riconoscimento del consenso di una chinasi, si possono prevedere siti di fosforilazione supposto di un substrato candidato e l'autenticità dei siti può essere convalidata. Il metodo più convincente per questa procedura è quello di mostrare l'abrogazione della fosforilazione in una proteina mutante in cui la predizioneD è sostituito da un aminoacido non fosforilabile ( vale a dire, sierina o treonina ad alanina, tirosina alla fenilalanina). Tuttavia, la produzione e l'isolamento delle proteine ​​mutanti richiedono molto tempo. Come alternativa alla fase iniziale della ricerca, il concorso di peptide chinasi competitivo è semplice e conveniente. Qui descriviamo un protocollo per un test di concorrenza peptidico in vitro e per la convalida del sito di fosforilazione.

Protocol

1. Sicurezza ATTENZIONE: Questo protocollo utilizza [γ- 32 P] -ATP per valutare l'attività di AMPK. Fosforo-32 è un isotopo radioattivo, che emette in gran parte le radiazioni beta. Poiché la dimensione di una particella beta è estremamente piccola, può facilmente penetrare l'abbigliamento e la pelle. L'esposizione esterna ed interna a radiazioni beta possono essere dannose per la salute umana, anche causando ustioni cutanee e danni ai tessuti. Eseguir…

Representative Results

La Figura 1 e la Figura 2 mostrano i risultati di esperimenti ripetuti nella carta precedentemente riportata 8 . Sono stati sintetizzati tre differenti oligopeptidi di 10 residui che imitavano i siti di destinazione AMPK (# 1, 148-157 comprendenti Ser153; # 2, 330-339 composti da Ser335 e # 3, 553-562 composti da Ser558). Vitro chinasi. La fosforilazione di Nrf2 da AMPK è stata notevolmente dimi…

Discussion

Come un modo semplice e conveniente per valutare l'autenticità dei siti di fosforilazione previsti mediati da AMPK, qui descriviamo un dosaggio in vitro di chinasi che può essere utilizzato per scoprire uno specifico sito di fosforilazione utilizzando peptidi competitivi e per verificarlo usando un mutante specifico del sito . I dati rappresentativi ottenuti dal saggio di attività AMPK competitivo in vitro hanno raggiunto i risultati di un saggio utilizzando una proteina mutante diretta sul sito…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Nazionale di Ricerca della Corea finanziata dal governo coreano (MSIP) (No. 2015R1A2A1A10052663 e No. 2014M1A3A3A02034698).

Materials

HEPES Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 15630
MgCl2 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 208337
EGTA Sigma-Aldrich, St. Louis, MO E3889
DTT Sigma-Aldrich, St. Louis, MO D9779
β-glycerophosphate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO G9422
Na3VO4 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 450243
Protease inhibitor cocktail Calbiochem, Nottingham, UK 539134
ATP Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A2383
AMP Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A1752
AMPK Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY 14-840
Nrf2 (WT) Abnova, Taipei City, Taiwan H00004780-P01
[γ-32P]-ATP PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA NEG502A
EZblue staining reagent Sigma-Aldrich, St. Louis, MO G1041
Pfu turbo DNA polymerase Agilent Technologies, Santa Clara, CA 600250
dNTP mix Agilent Technologies, Santa Clara, CA 200415-51 Avoid multiple thaw and freezing cycle
DpnI New England Biolabs, Ipswich, MA R0176S
LB broth Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands L1704
Ampicillin Affymetrix, Santa Clara, CA 11259
Agarose LE iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea 32034
HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan QDF100
Coomassie Brilliant Blue R-250 Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA 161-0400
Bovine Serum Albumin Bovogen Biologicals, Victoria, Australia BSA100
Glutathione Sepharose 4B GE Healthcare, Marlborough, MA 17-0756-01
Acetic Acid glacial Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea
Methyl alcohol Daejung Chemicals & Metals, Siheung, South Korea 5558-4410
Name Company Catalog Number Comments
Typhoon FLA 7000 GE Healthcare, Marlborough, MA 28-9558-09
SDS-PAGE kit Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA 1658001FC
Vacuum pump Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA 165-178
Gel dryer Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA 165-1746
Dancing shaker FINEPCR, Seoul, Korea CR300 The machine is needed for washing step
PCR machine Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA T100
Incubator/shakers N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea NB-205L
Microcentrifuges LABOGENE, Seoul, Korea 1730R
Chromatography columns Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA 732-1010

References

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Cite This Article
Joo, M. S., Koo, J. H., Shin, S., Yim, H., Kim, S. G. Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination. J. Vis. Exp. (123), e55708, doi:10.3791/55708 (2017).

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