Summary

Análisis de inducida por ácido retinoico Neural diferenciación de células madre embrionarias de ratón en cuerpos embrioides dos y tres dimensiones

Published: April 22, 2017
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Summary

Se describe una técnica para el uso de células madre embrionarias murinas para generar dos o tres cuerpos embrioides dimensionales. A continuación, explicamos cómo inducir la diferenciación neural de las células del cuerpo embrioides por ácido retinoico, y cómo analizar su estado de diferenciación de células progenitoras por inmunofluorescencia marcador e inmunotransferencia.

Abstract

Células madre embrionarias de ratón (CES) aislados a partir de la masa interna del blastocisto (típicamente al día E3.5), se pueden utilizar como sistema de modelo in vitro para estudiar el desarrollo embrionario temprano. En ausencia de factor inhibidor de leucemia (LIF), CES diferencian por defecto en las células precursoras neurales. Pueden ser amasaron en una de tres dimensiones (3D) agregada esférica denomina cuerpo embrioides (EB), debido a su similitud con el embrión etapa temprana. EBs se pueden sembrar en cubreobjetos recubiertos de fibronectina, donde se expanden por el crecimiento de dos extensiones (2D) dimensionales, o implantados en matrices de colágeno 3D donde continúan creciendo como esferoides, y se diferencian en las tres capas germinales: endodérmico, mesodérmico y ectodérmico. El cultivo de colágeno 3D imita el entorno in vivo más de cerca que la EBs 2D. El cultivo 2D EB facilita el análisis por inmunofluorescencia e inmunotransferencia para rastrear la diferenciación. Hemos desarrollado una diferenciación neuronal de dos pasosprotocolo ción. En el primer paso, EBs son generados por la técnica de gota colgante, y, simultáneamente, son inducidas a diferenciarse mediante la exposición a ácido retinoico (RA). En el segundo paso, la diferenciación neural avanza en un formato 2D o 3D en ausencia de AR.

Introduction

CES se originan a partir de la masa celular interna del blastocisto. Estas células son pluripotentes, es decir, tienen la capacidad de diferenciarse en cualquier tipo de célula del organismo de origen. CES diferenciación in vitro es de gran interés como un sistema experimental para la investigación de las vías y mecanismos de desarrollo. Ofrece un modelo de sistema potente y flexible para probar nuevos enfoques terapéuticos para la corrección de la disfunción de las células y los tejidos. EB recapitulan muchos aspectos de la diferenciación celular durante la embriogénesis temprana. En particular, EBs se pueden utilizar cuando la letalidad embrionaria hace que sea difícil determinar la base celular de los defectos embrionarios 1, 2. EBs pueden formarse ya sea por la gota colgante o técnicas de suspensión líquido 3. La ventaja de la primera es la capacidad de generar EBs de tamaño uniforme y la densidad, facilitando así la reproducibilidad experimental.

<p class = "jove_content"> Interacción con proteínas de adhesión de la matriz extracelular (ECM) puede afectar la motilidad y supervivencia de las células adherentes. En el sistema de cultivo 2D, la fibronectina se aplica a menudo para aumentar la adhesión de células al sustrato. La fibronectina es un componente de lámina basal reconocido por 10 tipos de superficie celular de integrina heterodímeros 4.

RA es un pequeño metabolito lipófilo de vitamina A que induce la diferenciación neural 5, 6. Las altas concentraciones de RA promueven la expresión génica neural y reprime la expresión de genes mesodérmico durante la formación de EB 7, 8. RA es producida por la vitamina A oxidación para retinaldehido por alcohol o retinol deshidrogenasa, seguido de oxidación retinaldehido al producto final por retinaldehido deshidrogenasa 9. diferenciación neural requiere transporte de RA desde el citoplasma al núcleo por celular proteína de unión a RA-2 (CRABP2). En el núcleo, RA se une a su complejo receptor cognado que consiste en un heterodímero RAR-RXR 10. Esto da como resultado el reclutamiento de co-transcripcional activadores, y la iniciación de la transcripción 9, 11. Además, RA promueve la degradación de fosforilados (activo) Smad1, antagonizando así BMP y SMAD de señalización 12. Además de estas actividades, RA aumenta la expresión de Pax6, un factor de transcripción que apoya la diferenciación neural 13. Señalización RA es modulada por sirtuin-1 (Sirt1), un dinucleótido de nicotinamida y adenina nuclear (NAD +) – enzima dependiente que deacetylates CRABP2, interfiriendo con su translocación al núcleo, y por lo tanto con RA de unión al heterodímero RAR-RXR 14, 15, 16.

e_content "> Nuestro objetivo en el diseño del protocolo de EB tratado con RA se describe aquí es optimizar la diferenciación neuronal con el fin de facilitar el análisis in vitro de las vías de señalización que regulan la diferenciación ESC en células precursoras neuronales. Una de las ventajas de este protocolo es la facilitación de el análisis de la función celular por inmunofluorescencia. EBs 3D no están bien penetrada por anticuerpos y son difíciles de imagen. EB disociación en una monocapa 2D en puntos de tiempo específicos durante la diferenciación neural facilita immunolabeling y de formación de imágenes de las células por microscopía confocal.

Protocol

1. Cultivo de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) Preparar medio MEF, medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, alta glucosa), suplementado con suero de 15% de bovino fetal (FBS). Coat placas de cultivo celular de 100 mm con solución de gelatina al 0,5% durante 30 min a temperatura ambiente (RT). Contar MEF utilizando un citómetro. Eliminar la solución de gelatina y se vierte inmediatamente medio MEF pre-calentado a 37 ° C. Rápidamente descongelar viales de mitomicina C MEF…

Representative Results

Oct4, Nanog, y Sox2 son los factores de transcripción básicos que confieren ESC auto-renovación y pluripotencia. Se aplicó el protocolo anterior para comparar la diferenciación neural de las ESC de tipo salvaje y de una cepa de ratones modificados genéticamente donde Syx, un gen que codifica para el factor de intercambio específico de RhoA Syx, se interrumpe. Habíamos implicados en la angiogénesis Syx 18. Nos dimos cuenta de las diferencias en lo…

Discussion

En este protocolo se presenta un método relativamente simple y accesible para estudiar la diferenciación neuronal de los CES murinos. En los protocolos anteriores, RA se añadió al medio a día 2 o el día 4 del EB de gota colgante 8 o por cultivo en suspensión 7, respectivamente, o inmediatamente después de la EB colgando agregación gota 21. En el protocolo ideamos, RA se añadió antes. A pesar de la introducción anterior de RA a EBs formad…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudio fue apoyado por el NIH subvención R01 HL119984 de AH

Materials

Materials
MEFs EMD Millipore PMEF-CF ESC feeder layer
ESC EMD Millipore CMTI-2
Cell culture dish (60 mm) Eppendorf 30701119 Cell culture
Cell culture dish (100 mm) Falcon 353003 Cell culture
Petri dish (100 mm) Corning 351029 Hanging drops
24-well plate Greiner Bio-One 662160 2D EBs
6-well plate Eppendorf 30720113 Transfection
Dark 1.5 ml centrifuge tube Celltreat Scientific Products 229437 RA stock solution
Microscope cover-glass Fisherbrand 12-545-80 Circular, 12 mm diameter
Superfrost-plus microscope slides Fisherbrand 12-550-15
3D collagen culture kit EMD Millipore ECM675 3D culture
Effectene Transfection Reagent Qiagen 301427 Stem cell transfection
Microcon Centrifugal Filters (10 kDa) EMD Millipore MRCPRT010 Protein concentration
Name  Company Catalog Number Comments
Reagents
DMEM Lonza 12-709F MEFs culture
IMDM Gibco 12440-046 ESCs culture
Fetal bovine serum (FBS) EMD Millipore ES-009-B ESCs culture
Gelatin Sigma-Aldrich G2625 Dish coating
LIF R&D Systems 8878-LF-025 To maintain ESC pluripotency
MEM Non-Essential Amino Acids Solutions Gibco 11140050 Cell culture
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023 Cell culture
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 Cell culture
Gentamicin Gibco 15750060 Cell culture
MycoZap Plus-PR Lonza VZA-2022 Cell culture
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-072 Cell culture
DMSO Sigma-Aldrich D2650
All-trans-retinoic acid Sigma-Aldrich R2625-50MG Induction of neural differentiation
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7030-50G Blocking and antibody dilution 
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787-100ML Cell membrane permeabilization
Cell strainer Corning 352360
Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI Life Tech. P36931 Mounting reagent
16% Paraformaldehyde  Electron Microscopy Sciences 15710 Cell fixation
Fibronectin R&D Systems 1030-FN Dish coating
PBS Gibco 10010049
Collagenase type I Worthington Biochem. Corp LS004196 EB dissociation
Name  Company Catalog Number Comments
Primary Antibodies
Nestin (Rat-401) Santa Cruz Biotech sc-33677 Detection of neural differentiation
Oct4 Santa Cruz Biotech sc-5279 Detection of neural differentiation
Nanog Bethyl Laboratories A300-398A Detection of neural differentiation
Sox2 Cell Signaling 3579 Detection of neural differentiation
Tubulin b3 (AA10) Santa Cruz Biotech sc-80016 Detection of neural differentiation
Name  Company Catalog Number Comments
Secondary Antibodies
Donkey anti-Mouse-Alexa555 Life Tech. A31570 Immunofluorescence
Donkey anti-mouse-Alexa488  Life Tech. A21202 Immunofluorescence
Name  Company Catalog Number Comments
Instruments
Wide-field microscope Nikon Eclipse TS100 Cell culture imaging
Confocal microscope Nikon C2 Immunofluorescence imaging

References

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Cite This Article
Yang, J., Wu, C., Stefanescu, I., Horowitz, A. Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies. J. Vis. Exp. (122), e55621, doi:10.3791/55621 (2017).

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