Metodi in vitro per il confronto obiettivo vincolante e CDC induzione Tra terapeutiche Anticorpi: Applicazioni nel Analisi Biosimilarity

Anticorpi terapeutici sono anticorpi monoclonali ricombinanti (mAbs) sviluppati per il trattamento di diverse patologie, incluso il cancro, autoimmuni e malattie croniche, disturbi neurologici, e altri ^1. Attualmente, la FDA ha concesso l'approvazione a più di 40 anticorpi monoclonali terapeutici, e più si prevede di raggiungere il mercato nei prossimi anni.

Rituximab è un anticorpo monoclonale chimerico IgG1 ad alta affinità approvato per il trattamento del linfoma CD20 ⁺ cellule B non-Hodgkin (NHL), CD20 ⁺ NHL follicolare, leucemia linfatica cronica, e l'artrite reumatoide ^{2, 3.} Il riconoscimento del CD20, che è sovraespressa in cellule B, da Rituximab induce apoptosi; attivazione del complemento; e cellule anticorpo-dipendente citotossicità mediata (ADCC) ^3. I brevetti di questo farmaco sono scaduti in Europa e negli Stati Uniti nel 2013 e 2016, Rispettivamente. Così, le aziende farmaceutiche di tutto il mondo stanno sviluppando biosimilari rituximab. Come in qualsiasi altro farmaco per il consumo umano, biosimilari richiedono l'approvazione da agenzie di regolamentazione. Le linee guida internazionali indicano che per anticorpi monoclonali, biosimilarity deve essere dimostrata confrontando le caratteristiche fisico-chimiche, la farmacocinetica, l'efficacia e la sicurezza dei nuovi prodotti e di riferimento ^4.

Di conseguenza, le metodologie utilizzate per le comparazioni devono valutare le caratteristiche strutturali e funzionali dei mAbs, in particolare quelli con rilevanza clinica. A tal fine, saggi in vitro mostrano diversi vantaggi rispetto esperimenti in vivo (recensiti Chapman et al.) ^5: i) in vitro sono più sensibili alle differenze tra il prodotto biosimilare e il riferimento proposto; ii) studi in vivo devono essere eseguite in specie, le quali sono per vari mAbsprimati non umani; e iii) poiché il meccanismo d'azione, la tossicologia preclinica, e gli effetti clinici del prodotto di riferimento sono ben noti, in studi in vivo con biosimilari non possono fornire ulteriori informazioni utili. Di conseguenza, guida dell'Unione europea per biosimilari consente ai candidati di entrare in studi clinici basati su robusti dati in vitro solo ^6.

Qui vi presentiamo due saggi veloci, economiche e semplici che valutano l'attività biologica di rituximab utilizzando cellule in coltura CD20 ^+. Questi test possono essere inclusi come parte dell'esercizio di comparabilità per i candidati biosimilari rituximab.

1. Valutazione del legame di target mediante citometria a flusso

1. Preparazione di materiali biologici e reagenti
   1. Realizzare 500 ml di terreno di coltura RPMI integrato con 10% di siero di bovini fetali inattivati ​​termicamente (H-IFBS).
   2. Cultura Le cellule del linfoma di Daudi Burkitt (Daudi) e le cellule di Daudi GFP ⁺ utilizzando RPMI e colaschi di coltura da 75 cm. Mantenere le colture a 37 ° C in un'atmosfera umidificata al 5% di CO ₂ fino a raggiungere 6 - 9 x 10 ⁵ cellule / ml.
   3. Creare 50 ml di tampone di colorazione diluendo 1/100 H-IFBS in PBS; Questo tampone è stabile a 2 - 8 ° C per almeno un mese.
   4. Preparare le soluzioni di prova per il riferimento e mAb biosimilar. Effettuare dieci diluizioni seriali 1: 2 (500 μL ciascuna) nel tampone di colorazione, a partire da 5 μg / mL.
   5. Utilizzare il tampone di colorazione per diluire IgG umano (controllo isotipo) a 5 μg / mL e IgG anti-umano del mouse PE-Cy5 (anticorpo secondario) al concentratura suggerito dal produttore.
   6. Preparare 4% paraformaldeide in PBS (tampone di fissaggio).
2. obiettivo vincolante
   1. Raccogliere il Daudi e sospensioni cellulari Daudi GFP ⁺ dai palloni di coltura da 75 cm ² e trasferirli in una provetta da centrifuga da 15 ml. Centrifugare a 400 xg per 5 min.
   2. Lavare le cellule aggiungendo 5 ml di PBS e centrifugare la sospensione cellulare a 400 xg per 5 min.
   3. Risospendere le cellule in PBS ed eseguire un numero di celle e analisi redditività con trypan blu. Utilizzare culture con livelli vitalità cellulare ≥ 95% per l'analisi.
   4. Diluire la sospensione cellulare a 4 x 10 ⁶ cellule / ml con tampone di colorazione fredda.
   5. In tubi da microcentrifuga da 1,5 ml, aggiungere 50 ml di sospensione cellulare a 100 ml di differenti concentrazioni di prova per il riferimento o mAbs biosimilari. Includere repliche per ogni condizione sperimentale.
   6. Preparare le provette aggiuntive per ilControllo isotipo (IgG1 umano invece di rituximab) e controllo negativo (anticorpo secondario senza anticorpo primario).
   7. Incubare a 4 ° C per 20 - 30 min.
   8. Lavare le cellule aggiungendo 1 mL di PBS e centrifugando la sospensione cellulare a 400 xg per 5 minuti a 10 ° C. Scartare il surnatante.
   9. Sospendere le cellule in 100 μL dell'anticorpo secondario e incubare per 20-30 minuti a 4 ° C, protetto dalla luce.
   10. Lavare le cellule due volte con PBS e sospendetele in 200 μl di buffer di fissaggio.
   11. Analizzare le celle su un citometro di flusso.
       NOTA: Il segnale rimane stabile per diversi giorni se i campioni sono memorizzati a 4 ° C e protetti dalla luce.
3. Acquisizione dei dati
   1. Aprire due diagrammi a punti in un foglio di lavoro del software operativo del flusso citometrico. Imposta l'FSC-A nei confronti di FSC-H nel primo e l'FSC-A nei confronti di SSA-A nel secondo. Aprire un istogramma per il canale PE-Cy5.
   2. Nella trama FSC-A e FSC-H fare una porta (R1) che seleziona gli eventi singoli ( Figura 1A ).
   3. Impostare la popolazione R1 nel punteggio FSC-A e SSA-A e quindi fare una nuova porta (R2) selezionando le cellule target ( Figura 1B ). Impostare la popolazione R2 nell'istogramma di intensità PE-Cy5 per visualizzare la distribuzione di frequenza delle celle.
   4. Regolare il limite inferiore di intensità di fluorescenza (FI) per il canale PE-Cy5 usando il controllo negativo e isotipo ( Figura 1C ).
   5. Acquisire 10.000 eventi all'interno di R2 dal campione con la concentrazione più elevata del prodotto di riferimento. FI di questo campione dovrebbe essere il più alto atteso ( Figura 1C ).
   6. Acquisire il resto dei campioni.
   7. Per ogni campione, ottenere l'intensità media di fluorescenza (MFI) nel canale PE-Cy5.
   8. Per i campioni con riferimento o mAb biosimilar, calcolare la differenza tra il campione MFI e quello del controllo isotipo (ΔMFI).

2. Valutazione del CDC

1. Preparazione di materiali biologici e reagenti
   1. Preparare il terreno di coltura cellulare e coltivare le cellule Daudi e Daudi GFP ⁺ come descritto in precedenza (passaggi 1.1.1 - 1.1.2).
      NOTA: Inoltre, il dosaggio CDC richiede RPMI senza siero.
   2. Diluire il normale complemento umano umano (NHSC) 1: 2 con RPMI senza siero. Preparare 2,5 ml.
   3. Preparare 1 mL di NHSC disattivato a caldo (30 min / 56 ° C) diluito 1: 2 con RPMI.
   4. Preparare set di soluzioni di test per il riferimento e mAbs biosimilar in RPMI senza siero. Fate dieci diluizioni (200 μL ciascuna) da 1 a 0,025 μg / ml.
2. Esame CDC
   1. Raccogliere le cellule Daudi e Daudi GFP ⁺ dalle culture e quantificare la vitalità cellulare (vedere punti 1.2.1 - 1.2.3).
   2. Preparare una sospensione cellulare con 4 x 10 ⁵ cellule / mL in RPMI senza siero.
   3. Inserisci50 ml di sospensione cellulare a 50 microlitri di ogni riferimento o concentrazione biosimilare prova mAb a 96 pozzetti conico (V) -bottom micropiastre. Includere repliche per ogni condizione sperimentale.
   4. Preparare pozzi addizionali per il controllo negativo (cioè senza mAb), controllo morte basale (cioè, inattivato al calore NHSC in presenza di mAb), ed il controllo positivo di colorazione (ossia, cellule esposte a 50 ml di 70% EtOH).
   5. Incubare le cellule per 20 - 30 min a 37 ° C in un'atmosfera umidificata CO ₂ 5%.
   6. Aggiungere 50 ml di NHSC (diluito 1: 2) a ciascun pozzetto e incubare le cellule opsonizzati per 2,5 ore a 37 ° C in un'atmosfera umidificata CO ₂ 5%. Utilizzare NHSC inattivato al calore nei pozzetti di controllo della morte basali.
   7. Centrifugare a 400 xg per 5 min a 10 ° C. Eliminare il surnatante.
   8. Lavare le cellule aggiungendo 150 ml di PBS e centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 400 xg e 10 ° C. diScardare il surnatante.
   9. Stain i campioni con 7-aminoactinomycin (7-AAD), come precedentemente descritto ^{7 , 8} .
   10. Analizzare le cellule su un citometro di flusso nello stesso giorno.
3. Acquisizione dei dati
   1. Aprire due diagrammi a punti in un foglio di lavoro del software operativo del flusso citometrico. Impostare i diagrammi come nei passaggi 1.3.1 - 1.3.3 ( Figura 2A-B ). Creare una terza trama che è un punto-plot per GFP rispetto a 7-AAD nella popolazione R2.
   2. Definire i limiti FI adeguati utilizzando le cellule Daudi, le cellule Daudi GFP ⁺ e il controllo positivo di morte ( Figura 2C ).
   3. Per ogni campione, misurare la percentuale di celle target 7-AAD ⁺ . Acquisire almeno 5.000 eventi da R2.
   4. Calcolare la citotossicità specifica indotta da mAb sottraendo la percentuale di 7-AAD ⁺ nel controllo della morte basale dalla percentuale trovata nei campioni con differenteConcentrazioni di mAbs ( Figura 2D ).

3. Analisi della biosimilarità

1. Inserisci i valori di concentrazione e risposta in un software di grafica.
2. Generare grafici e calcolare regressioni non lineari con le seguenti considerazioni: i) utilizzare la trasformazione log della concentrazione mAb come "X"; Ii) utilizzare il modello matematico a pendenza variabile (Y = risposta minima + (risposta massima - risposta minima) / 1 + 10 ^ ((LogEC ₅₀ -X) * pendenza della collina)); E iii) vincolare i valori inferiori a zero, poiché la risposta basale è stata sottratta.
   NOTA: si prevedono curve con forma sigmoidale simmetrica.
3. Confronta entrambi i dispositivi non lineari con una configurazione globale utilizzando un test F (molti programmi software grafici includono questa funzione).
   NOTA: Tali test stabiliscono l'ipotesi nullo che la risposta massima, logEC ₅₀ e la pendenza Hill sono uguali per i due set di dati, che corrispondono adomanda biologica destinato ad essere affrontato.

Usando i protocolli sopra descritti, il binding obiettivo e l'induzione CDC di rituximab di riferimento sono stati confrontati in parallelo con quelli di un rituximab biosimilar prodotto e commercialmente disponibile in Asia.

Nelle cellule di Daudi, entrambi i mAb hanno legato CD20 in modo dipendente dalla concentrazione ( Figura 1D ). Le regressioni non lineari dei dati di legame hanno mostrato una r ² di 0.978 e 0.848 per riferimento e rispettivamente di rituximab biosimilar ( Figura 1E ). L'analisi statistica delle curve di concentrazione-risposta ha mostrato che essi, e quindi i parametri farmacodinamici calcolati da essi, sono significativamente diversi tra mAbs (P <0,0001). La risposta massima per la biosimilar è stata di 2,16 volte più bassa di quella del prodotto di riferimento. Questi risultati suggeriscono che i due mAb valutati hanno diverse capacità di legare CD20 espresso sul meMbrane di cellule leucemiche.

L'induzione di CDC è stata paragonata anche ai due mAb. I riferimenti ei prodotti biosimilar hanno stimolato il CDC nelle cellule di Daudi in maniera dipendente dalla concentrazione ( Figura 2E ). Importante, le concentrazioni a cui i CDC sono stati indotti da mAb erano diversi da quelli richiesti per il binding target. Le regressioni non lineari dei dati CDC hanno mostrato r ² > 0,980 per entrambi i prodotti. Il confronto statistico delle curve di concentrazione-risposta ha indicato che sono significativamente differenti (P ​​<0,01), rendendo il biosimilar meno potente. Questi dati indicano che la capacità di indurre CDC è diversa per i mAb analizzati.

Figura 1. In vitro Target-binding di anti-CD20 mAb terapeutici. Le cellule di Daudi GFP ⁺ sono state esposte a differenzeconcentrazioni ent dei mAbs (4,8 ng / mL a 5 ug / mL) e poi colorate con anticorpo secondario anti-umano PE-Cy5-coniugato. Intensità di fluorescenza (FI) è stata misurata mediante citofluorimetria a flusso su eventi singoli (A), con dimensioni e granularità corrispondenti a quelli delle cellule Daudi (B). Cellule non colorate (grigio chiaro), controlli isotipo (grigio scuro), e 5 ug / ml di rituximab riferimento (blu) sono stati impiegati per impostare i limiti FI (C). Entrambi mAbs valutati vincolati cellule Daudi in modo concentrazione-dipendente (D). Risposte (ΔMFI; vedi testo) sono stati usati per generare le curve concentrazione-risposta per riferimento (blu) o bioanalogo Rituximab (nero) (E). confronto statistico delle regressioni non lineari mostrato differenze tra i mAbs (P <0.0001; test esatto di Fisher). Fare clic qui per visualizzare un Versi più grandisu questa figura.

Figura 2. CDC induzione da anti-CD20 mAb terapeutico. Cellule Daudi GFP ⁺ opsonizzati con diverse concentrazioni di anticorpi monoclonali sono stati esposti al complemento umano. Morte cellulare è stata valutata mediante 7-AAD colorazione e l'analisi citofluorimetrica dell'intensità di fluorescenza (FI) su eventi singoli (A), con dimensioni e granularità corrispondenti alle cellule Daudi (B). GFP senza macchia (nero) e le cellule GFP ⁺ (verde) e le cellule etanolo ucciso (rosso) sono stati inclusi come controlli (C). Quantificazione degli AAD-7 ⁺ cellule nel controllo basale-morte (grigio) e campioni rituximab (blu) consentite per il calcolo della citotossicità mAb indotta (D). Curve concentrazione-risposta ottenute per riferimento (blu) o bioanalogo (nero) Rituximab (E). Il confronto statistico delle regressioni non lineari ha mostrato differenze tra le risposte indotte dai due mAb (P <0.01, Fisher exact test). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1. Anticorpi monoclonali approvati per uso terapeutico, con cellule target per il test CDC. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La scadenza brevettuale di un mAb terapeutico sta promuovendo lo sviluppo di biosimilari. Pertanto, vi è la necessità di metodi semplici che possono identificare le differenze nelle attività clinicamente rilevanti di questi prodotti. Le cellule colture CD20 ⁺ sono state impiegate per la valutazione di due funzioni funzionali chiave di rituximab: binding target e induzione CDC. L'attività precedente richiede il riconoscimento di CD20 dalla regione Fab della mAb, mentre quest'ultima dipende principalmente dall'interazione della regione Fc con il suo complemento ⁹ . Pertanto, questi dosaggi forniscono un modo per collegare le caratteristiche strutturali e funzionali dei mAb.

Il legame target di mAb terapeutici viene solitamente valutato mediante calorimetria di titolazione isoterma (ITC), risonanza plasmatica di superficie (SPR) o interferometria biolayer ^{10 , 11 , 12} . Questi esami permettono di affermareCalcolo della finitezza, ma richiedono attrezzature e formazione specializzati. Il protocollo qui descritto valuta l'associazione di target in un confronto lato a lato per identificare le differenze tra i prodotti, anche senza dati di affinità. Il metodo è semplice e impiega un contesto cellulare pertinente per la valutazione dell'attività. D'altra parte, l'induzione di CDC mediante rituximab può essere valutata con la misurazione ATP ¹³ , la quantificazione della release di lattato deidrogenasi (LDH) ¹⁴ o alamarBlue ¹⁵ e dei test MTT ¹⁶ . Il metodo riportato qui, utilizzando la colorazione 7-AAD, ha uno sfondo basso e può essere combinato con altre macchie per l'analisi citometrica a flusso multiparametrico.

Negli esperimenti rappresentativi presentati, le curve dose-risposta hanno montato il modello logistico a quattro parametri, consentendo il calcolo della pendenza EC ₅₀ , della collina e della risposta massima. In particolare, le gamme di concentraticomponenti impiegati per generare tali curve erano differenti per ciascun saggio, evidenziando l'importanza di analizzare e definire intervalli adeguati in esperimenti preliminari. Modifiche dei reagenti chiave, come fluorocromi e complementi, o l'uso di una linea cellulare con un diverso livello target, possono spostare il campo effettivo di concentrazioni.

Analisi statistica identificato differenze tra un impasto di Rituximab biosimilare disponibile in commercio in Asia e il prodotto di riferimento, sia nel legame bersaglio e CDC induzione. È importante considerare che, anche quando il processo di fabbricazione dei mAbs è strettamente controllata, ogni attributo del prodotto di riferimento mostra un intervallo. Di conseguenza, il numero minimo di lotti che dovrebbe essere testato durante la valutazione di un simile bioterapeutico dipende dalla misura della variabilità del prodotto di riferimento e sul dosaggio variabilità ⁴ .Così, questi protocolli devono essere applicati a essere differenteNt durante la valutazione della comparabilità.

I metodi presentati possono essere estrapolati ad altre coppie di mAb terapeutici target, fintanto che le cellule che esprimono l'antigene sono accessibili. La Tabella 1 elenca i mAb terapeutici diversi dal rituximab per i quali l'induzione CDC è rilevante per l'efficacia clinica e compila informazioni sui modelli cellulari riportati in precedenza per ogni mAb.

In conclusione, i due test descritti qui sono semplici, veloci e poco costosi, consentendo la loro esecuzione nella maggior parte dei laboratori. I metodi possono essere utilizzati durante i primi passi dello sviluppo biosimile o dopo l'approvazione regolamentare per il confronto batch-to-batch durante la produzione.